葡萄糖依諾沙星注射液的異常毒性檢查與體外溶血反應研究

翁鷺娜，宋婧，洪穎，張盈（.廈門市食品藥品質量檢驗研究院，福建廈門60；.廈門大學實驗動物中心，福建廈門6005；.福建省食品藥品質量檢驗研究院，福州5000）

葡萄糖依諾沙星注射液的異常毒性檢查與體外溶血反應研究

翁鷺娜1＊，宋婧2，洪穎1，張盈3（1.廈門市食品藥品質量檢驗研究院，福建廈門361012；2.廈門大學實驗動物中心，福建廈門361005；3.福建省食品藥品質量檢驗研究院，福州350001）

目的：對葡萄糖依諾沙星注射液進行異常毒性檢查和體外溶血反應研究，為其安全用藥提供參考。方法：根據2015年版《中國藥典》（二部）附錄中“異常毒性檢查法”，使用小鼠進行葡萄糖依諾沙星注射液半數致死量（LD50）的測定和異常毒性限值的設定。根據2015年版《中國藥典》（二部）附錄中“溶血與凝聚檢查法”，使用兔血進行體外溶血和凝聚反應的研究。結果：測得葡萄糖依諾沙星注射液對小鼠的LD50為248.9 mg/kg，其異常毒性檢查項設定的限值為28.4 mg/kg，按此限值檢查結果均符合相關規定。以臨床最大劑量（0.2 g/100 mL）進行溶血與凝聚反應的檢查結果均符合規定。結論：為減少臨床不良反應和確保質量標準的可行性，葡萄糖依諾沙星注射液的異常毒性檢查限值應設定為28.4 mg/kg。

葡萄糖依諾沙星注射液；異常毒性；溶血反應；體外

依諾沙星屬于第三代氟喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌能力強、體內吸收分布廣等特點[1]，在臨床上廣泛用于敏感菌所致的咽喉、支氣管、肺、尿路、前列腺等部位感染[2-4]。但由于依諾沙星具有光敏毒性，作為注射液靜脈給藥時易引起患者皮膚紅腫、疼痛等，嚴重時易引起靜脈炎[5-6]，因此根據國家藥品計劃抽驗《國家藥品計劃抽驗項目任務書》對于依諾沙星注射液質量標準提高工作的要求，筆者重新考察了依諾沙星注射液的異常毒性，并對其體外溶血反應進行了研究，初步評價依諾沙星注射液的安全性，以期為其臨床使用提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

葡萄糖依諾沙星注射液（國內A公司，共11批，對應批號、規格詳見表1）；5%葡萄糖注射液（浙江國境藥業有限公司，批號：B14052702，規格：250 mL∶12.5 g）；0.9%氯化鈉注射液（江西科倫藥業有限公司，批號：B130127G2，規格：100 mL∶9 g）。

表1 葡萄糖依諾沙星注射液的批號、規格Tab1 Specifications，batch number of Gluconate enoxacin injection

1.2 動物

普通級新西蘭兔，♀，體質量2～3 kg，購自上海市松江區松聯實驗動物場，動物生產許可證號為SCXK（滬）2012-0011；SPF級ICR小鼠，♀♂各半，體質量18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證號為SCXK（滬）2012-0002。

2 方法與結果

2.1 異常毒性檢查

2.1.1 半數致死量（LD50）的測定取小鼠50只，分成5組，以序號命名，每組10只，♀♂各半，實驗前禁食6 h，自由飲水。根據預實驗結果確定依諾沙星的LD50范圍，以5%葡萄糖注射液為溶劑制備質量濃度分別為17.5、14.9、12.6、10.7、9.1 mg/mL的葡萄糖依諾沙星注射液溶液。各組小鼠尾iv上述不同質量濃度的葡萄糖依諾沙星注射液溶液，給藥體積均為0.02 mL/g。嚴密觀察給藥后72 h內小鼠的反應及死亡情況，記錄死亡只數[7-8]。結果顯示，給藥后部分小鼠出現呼吸急促、四肢抽搐的中毒癥狀，其中26只小鼠給藥后1 min內驚厥死亡，剩余小鼠繼續觀察。第2天后，剩余小鼠情況良好，活動自如。按Bliss法計算葡萄糖依諾沙星注射液對小鼠的LD50為248.9 mg/kg，95%置信區間為227.0～272.9 mg/kg。葡萄糖依諾沙星注射液的小鼠LD50測定結果見表2。

表2 葡萄糖依諾沙星注射液的小鼠LD50測定結果Tab2 Determination results of LD50value of Gluconate enoxacin injection for mice

2.1.2 異常毒性檢查限值的設定及異常毒性檢查將葡萄糖依諾沙星注射液的LD50置信區間下限的1/8劑量（28.4 mg/kg）設定為該注射液的異常毒性檢查限值[7]。取小鼠60只，隨機分成12組，以序號命名，每組5只，♀♂各半，給藥劑量均為28.4 mg/kg，分別尾iv終質量濃度為1.1 mg/mL的11批葡萄糖依諾沙星注射液溶液，并設5只尾iv 5%葡萄糖注射液的小鼠作為空白對照組，給藥體積為每只0.5 mL。給藥后即時觀察各組小鼠反應情況，嚴密觀察并記錄各組小鼠給藥后48 h內的反應、死亡情況和體質量變化。結果顯示，小鼠外觀、精神狀態、行為活動、攝食、大小便、毛色和呼吸等均未見異常，鼻、眼、口腔均無異常分泌物，直至實驗結束時，各組小鼠均未死亡；與空白對照組比較，各給藥組小鼠均無異常反應，體質量均無明顯變化（P＞0.05），解剖觀察其內臟器官未見異常病變，具體結果見表3。

2.1.3 臨床最大劑量的異常毒性檢查參照葡萄糖依諾沙星注射液說明書，以臨床最大劑量進行異常毒性檢查，考察其臨床用量安全性。參照葡萄糖依諾沙星注射液說明書，重癥患者最大劑量每日不超過0.6 g，以成人體質量70 kg計算，則重癥患者每日最大劑量不超過8.6 mg/kg，根據人和小鼠的等效劑量比率，則小鼠每日最大劑量不超過78 mg/kg[8]。按“2.1.2”項下方法分組、給藥，給藥劑量改為78 mg/kg，另外不設立空白對照組。結果顯示，給藥后所有小鼠約在1 min內出現呼吸急促、活動減少的現象，之后恢復正常；部分小鼠在給藥后48 h內出現尾部壞死現象；實驗結束時，全部小鼠均未死亡，具體結果見表4。為了分析毒性與注射液中雜質的關系，筆者按2015年版《中國藥典》（四部）中相關方法[7]檢測了11批葡萄糖依諾沙星注射液的D-葡萄糖酸-δ-內酯含量，結果見表4。

表3 葡萄糖依諾沙星注射液的異常毒性檢查結果（注射劑量為28.4 mg/kg，±s，n＝5）Tab3 Results of abnormal toxicity test for Gluconate enoxacin injection（injection dosage of 28.4mg/kg，±s，n＝5）

表3 葡萄糖依諾沙星注射液的異常毒性檢查結果（注射劑量為28.4 mg/kg，±s，n＝5）Tab3 Results of abnormal toxicity test for Gluconate enoxacin injection（injection dosage of 28.4mg/kg，±s，n＝5）

組別空白對照組1組2組3組4組5組6組7組8組9組10組11組藥物5%葡萄糖注射液葡萄糖依諾沙星注射液葡萄糖依諾沙星注射液葡萄糖依諾沙星注射液葡萄糖依諾沙星注射液葡萄糖依諾沙星注射液葡萄糖依諾沙星注射液葡萄糖依諾沙星注射液葡萄糖依諾沙星注射液葡萄糖依諾沙星注射液葡萄糖依諾沙星注射液葡萄糖依諾沙星注射液批號B14052702 3130801 3131101 3131102 3130301 3130701 3130702 3130901 3131201 3131202 3130902 3130802規格250 mL∶2.5 g 2 mL∶0.1 g 2 mL∶0.1 g 2 mL∶0.1 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g小鼠體質量，g給藥前19.7±0.5 20.0±0.4 19.9±0.2 19.4±0.3 19.6±0.2 20.1±0.4 19.7±0.5 20.2±0.3 19.9±0.5 20.4±0.4 19.9±0.3 19.5±0.4給藥后21.1±0.3 21.0±0.5 21.1±0.4 20.6±0.4 20.8±0.3 21.3±0.6 21.0±0.3 21.5±0.5 21.6±0.4 21.7±0.6 21.1±0.4 20.5±0.5

表4 葡萄糖依諾沙星注射液臨床最大劑量的異常毒性檢查結果（注射劑量為78 mg/kg，±s，n＝5）Tab4 Results of abnormal toxicity test for Gluconate enoxacin injection of clinical maximum dose（injection dosage of 78 mg/kg，±s，n＝5）

表4 葡萄糖依諾沙星注射液臨床最大劑量的異常毒性檢查結果（注射劑量為78 mg/kg，±s，n＝5）Tab4 Results of abnormal toxicity test for Gluconate enoxacin injection of clinical maximum dose（injection dosage of 78 mg/kg，±s，n＝5）

小鼠體質量，g組別批號規格反應情況1組2組3組4組5組6組7組8組9組10組11組3130801 3131101 3131102 3130301 3130701 3130702 3130901 3131201 3131202 3130902 3130802 2 mL∶0.1 g 2 mL∶0.1 g 2 mL∶0.1 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g 5 mL∶0.2 g D-葡萄糖酸-δ-內酯含量，%2.7 3.6 2.7 2.6 3.0 2.2 2.7 4.3 2.7 2.6 2.5給藥前19.6±0.2 19.5±0.2 19.7±0.1 19.8±0.1 19.8±0.1 19.6±0.1 19.7±0.1 19.6±0.3 19.7±0.1 19.7±0.1 19.7±0.1給藥后21.0±0.2 20.6±0.1 20.7±0.1 21.1±0.2 21.1±0.2 20.8±0.1 21.1±0.1 20.9±0.4 21.2±0.2 21.3±0.2 21.2±0.2 5只均呼吸急促、活動減少，其中2只尾部壞死5只均呼吸急促、活動減少，其中2只尾部壞死5只均呼吸急促、活動減少，其中1只尾部壞死5只均呼吸急促、活動減少5只均呼吸急促、活動減少，其中2只尾部壞死5只均呼吸急促、活動減少5只均呼吸急促、活動減少，其中1只尾部壞死5只均呼吸急促、活動減少，其中2只尾部壞死5只均呼吸急促、活動減少5只均呼吸急促、活動減少5只均呼吸急促、活動減少

2.2 體外溶血與凝聚檢查

[7，9]方法，以兔血進行體外溶血和凝聚試驗。取潔凈試管5只，編號：1、2號管為供試品管，3號管為陰性對照管，4號管為陽性對照管，5號管為供試品對照管。按表5所示依次加入2%紅細胞混懸液、0.9%氯化鈉注射液、蒸餾水和葡萄糖依諾沙星注射液（按每0.2 g加入到5%葡萄糖注射液100 mL內溶解），混勻后，立即置于（37±0.5）℃的恒溫箱中進行溫育，3 h后觀察各試管的溶血和凝聚反應情況。結果顯示，3號管無溶血和凝聚發生，紅細胞全部下沉，上清液無色澄明；4號管有溶血發生，溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留；5號管沒有加入紅細胞，所以溶液澄清透明無色；1、2號管3 h內均未發生溶血和凝聚，故以臨床用藥濃度（0.2 g/100 mL）作為限值濃度。體外溶血和凝聚試驗結果見表6（表中，“+”表示溶血或凝聚，“-”表示不溶血或不凝聚）。

表5 體外溶血和凝聚試驗設計Tab5 Design for in vitro hemolysis and agglomeration test

表6 體外溶血和凝聚試驗結果Tab6 Results of in vitro hemolysis and agglomeration test

3 討論

3.1 建議異常毒性檢查限值為28.4 mg/kg

本實驗通過測定葡萄糖依諾沙星注射液對小鼠的LD50，設定其異常毒性檢查限值。首先，將LD50可信限下限1/8劑量（28.4 mg/kg）設定為該注射液異常毒性檢查限值，該劑量下各給藥組小鼠均無異常反應，且實驗結束時體質量增加，說明設定的異常毒性檢查限值28.4 mg/kg是安全可靠的。其次，以臨床最大給藥劑量78 mg/kg進行異常毒性檢查，給藥后1 min內異常毒性反應明顯，雖然1 min之后小鼠恢復正常，無死亡現象，但仍表明該劑量使用存在安全隱患。從表4結果可知，內酯含量越高，出現異常毒性反應越明顯，部分小鼠尾部出現壞死現象，推測可能與該注射液會產生靜脈炎副作用有關。D-葡萄糖酸-δ-內酯是該注射液中的唯一輔料，提示該注射液中引起異常毒性反應的物質可能是輔料D-葡萄糖酸-δ-內酯或及其相關的代謝產物，且異常毒性反應與內酯含量呈正相關性。為使依諾沙星注射液質量標準提高后的質量標準切實可行，建議將該品種的異常毒性檢查限值設置為28.4 mg/kg。

3.2 溶血和凝聚反應檢查限值為臨床用藥濃度

本試驗對11批葡萄糖依諾沙星注射液進行了體外溶血和凝聚檢查。結果表明，11批樣品在3 h內均未發生溶血和凝聚反應，但是第8組樣品（批號：03131201，規格：5 mL∶0.2 g）在2 h后出現紅細胞懸液顏色加深現象。表4結果顯示，第8組樣品在11批樣品中D-葡萄糖酸-δ-內酯含量最高（4.3%），而其他批次樣品D-葡萄糖酸-δ-內酯含量均低于4%，且在觀察時間3 h內均未出現異常。這提示葡萄糖依諾沙星注射液雜質含量的高低可能對其溶血和凝聚性存在影響。但由于缺少藥動學方面的研究資料，尚不知曉葡萄糖依諾沙星注射液靜脈給藥后，是以原型還是依諾沙星與D-葡萄糖酸-δ-內酯形成的復合物入血，同時也不了解相應物質在體內的血藥峰濃度、血漿蛋白結合率以及消除半衰期，因此無法判斷藥液使紅細胞懸液顏色變深是否對臨床用藥安全性存在影響。在試驗過程中筆者僅對1家企業生產的葡萄糖依諾沙星注射液進行了研究，缺乏代表性，尚不具有普遍意義。另一方面本品的原液具有溶血作用，最終確定的溶血和凝聚反應檢查限值為臨床用藥濃度（0.2 g/100 mL），以其進行靜脈注射用藥，可以達到《注射劑安全性指導原則》中的要求。

3.3 依諾沙星注射液毒性研究需要進一步深入

藥品上市后再評價是對已批準的藥品在社會人群中的療效、不良反應、用藥方案以及藥物穩定性、藥物經濟學等方面進行科學評估。藥物的活性成分及其代謝產物、輔料、有關物質及其理化性質（如pH值、滲透壓等）均有可能引起毒性反應以及溶血和凝聚的發生[10-13]。目前，對葡萄糖依諾沙星注射液的毒性研究缺少深度，主要集中在對綜述、不良反應病例的報道和分析層面，而對其毒性深入研究甚少。因此，探尋解決葡萄糖依諾沙星注射液不良反應的應對措施迫在眉睫，且有很大的應用價值。本試驗不僅為依諾沙星進一步結構改造、降低毒性及不良反應提供了依據，更有助于降低依諾沙星注射液臨床使用中的風險，確?；颊叩挠盟幇踩?/p>

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Abnormal Toxicity Test and Study on the in vitro Hemolytic Reaction of Gluconate Enoxacin Injection

WENG Luna1，SONG Jing2，HONG Ying1，ZHANG Ying（31.Xiamen Institute for Food and Drug Quality Control，Fujian Xiamen 361012，China；2.Laboratory Animal Center of Xiamen University，Fujian Xiamen 361005，China；3.Fujian Institute for Food and Drug Quality Control，Fuzhou 350001，China）

OBJECTIVE：To conduct the abnormal toxicity test and study on the in vitro hemolytic reaction of Gluconate enoxacin injection，and provide reference for its safe use.METHODS：According to“Test for Abnormal Toxicity”in Chinese Pharmacopoeia（2015 edition，Vol.Ⅱ），half lethal dose（LD50）of Gluconate enoxacin injection and setting of abnormal toxicity limit were carried out in mice.According to“Test for Haemolysis and Agglomeration”in Chinese Pharmacopoeia（2015 edition，Vol.Ⅱ），study for the in vitro hemolytic and agglomeration reaction was carried out in rabbits.RESULTS：The LD50of Gluconate enoxacin injection for mice was 248.9 mg/kg；the setting limit of abnormal toxicity test was 28.4 mg/kg，and the results derived from the test using this limit met requirements.The haemolysis and agglomeration results derived from the test using clinical maximum concentration（0.2 g/100 mL）met requirements.CONCLUSIONS：In order to reduce the clinical ADR and feasibility of ensuring quality standard，the abnormal toxicity limit of Gluconate enoxacin injection should be set as 28.4 mg/kg.

Gluconate enoxacin injection；Abnormal toxicity；Hemolysis reaction；in vitro

R927

A

1001-0408（2017）31-4398-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.31.20

＊副主任藥師。研究方向：藥理毒理學檢驗。電話：0592-5619827。E-mail：lnwyjyl@163.com

2017-03-16

2017-08-17）

（編輯：鄒麗娟）