β- 欖香烯對VEGF誘導的人臍靜脈內皮細胞遷移的影響及機制

賀惠娟，邢彩珍，熊振芳

(湖北中醫藥大學，武漢430065)

·基礎研究·

β- 欖香烯對VEGF誘導的人臍靜脈內皮細胞遷移的影響及機制

賀惠娟，邢彩珍，熊振芳

(湖北中醫藥大學，武漢430065)

目的探討β- 欖香烯對血管內皮生長因子(VEGF)誘導的人臍靜脈內皮細胞遷移的影響及其作用機制。方法人臍靜脈內皮細胞EA.hy926體外傳代培養，隨機分為對照組、VEGF組、VEGF+欖香烯組。對照組僅予無血清的DMEM培養基處理；VEGF組在對照組基礎上予適量VEGF，使其終濃度為10 ng/mL；VEGF+欖香烯組在VEGF組基礎上予適量β- 欖香烯，使其終濃度為100 μg/mL。各組處理24 h，收集細胞，采用Transwell小室法檢測細胞遷移能力，Real- time PCR法檢測細胞轉錄因子ETS1及遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表達，JASPAR數據庫分析遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2啟動子序列中可能的轉錄因子ETS1結合位點。結果對照組、VEGF組、VEGF+欖香烯組細胞遷移數分別為(9.4±3.7)、(50.4±13.9)、(23.7±8.4)個；與對照組比較，VEGF組細胞遷移能力明顯增強(P<0.05)；與VEGF組比較，VEGF+欖香烯組細胞遷移能力明顯降低(P<0.05)。與對照組比較，VEGF組細胞轉錄因子ETS1及遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA相對表達量均明顯升高(P均<0.05)；與VEGF組比較，VEGF+欖香烯組細胞轉錄因子ETS1及遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA相對表達量均明顯降低(P均<0.05)。在遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2啟動子序列中分別發現1、2、7個轉錄因子ETS1結合位點。結論β- 欖香烯可抑制VEGF誘導的人臍靜脈內皮細胞遷移，其機制可能與抑制轉錄因子ETS1表達，調控RhoGTP酶家族遷移相關分子CDC42、RAC1和RAC2的轉錄表達有關。

β- 欖香烯；人臍靜脈內皮細胞；細胞遷移；血管內皮生長因子；轉錄因子；RhoGTP酶家族遷移相關分子

血管新生對惡性實體腫瘤的生長和轉移具有極其重要的作用[1]，而血管內皮細胞遷移是血管新生的重要環節[2]。因此，阻止血管內皮細胞遷移有可能抑制惡性實體腫瘤的生長和轉移。β- 欖香烯是從姜科姜黃屬多種植物中提取的中藥單體物質，已被國家藥監局批準用于多種惡性實體腫瘤和癌性胸腹水的治療，并取得了較好的療效[3]，其主要作用機制是阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡[4,5]。但其對血管內皮細胞遷移的影響及機制尚不完全明了。2016年1～5月，本研究觀察了β- 欖香烯對血管內皮生長因子(VEGF)誘導的人臍靜脈內皮細胞遷移的影響，同時檢測細胞轉錄因子ETS1和遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表達，分析RhoGTP酶家族遷移相關分子序列中可能的轉錄因子ETS1結合位點，旨在探討β- 欖香烯對人臍靜脈內皮細胞遷移的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞EA.hy926購自中國科學院上海細胞庫。β- 欖香烯和VEGF購自美國Sigma公司。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。ABI 7500型實時熒光定量PCR系統購自美國Life Tech公司，奧林巴斯IX51顯微鏡購自日本Olympus株式公社。DMEM、FBS、胰酶和TRIzol購自美國Gibco公司。逆轉錄試劑盒和SYBR熒光定量試劑購自北京天根生化科技有限公司。Transwell板和Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 細胞分組處理 人臍靜脈內皮細胞EA.hy926傳代培養，隨機分為對照組、VEGF組和VEGF+欖香烯組。對照組僅予無血清的DMEM培養基處理24 h。VEGF組在對照組基礎上予適量VEGF，使其終濃度為10 ng/mL，處理24 h；VEGF+欖香烯組在VEGF組基礎上予適量β- 欖香烯，使其終濃度為100 μg/mL，處理24 h。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 細胞遷移能力 采用Transwell小室法。收集各組處理24 h細胞，制成密度為2.5×105個/mL的細胞懸液備用。取細胞懸液200 μL加入Transwell小室上室，下室加入各組相應的培養基。培養12 h，取出小室，棄去孔中培養基，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，然后加入0.1%結晶紫染色。倒置顯微鏡下，隨機選擇5個400倍視野，計數遷移細胞數。

1.3.2 轉錄因子ETS1及遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表達 采用Real- time PCR法。收集各組處理24 h細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉為cDNA，然后進行PCR擴增。引物序列：ETS1上游引物：5′-GAGTCAACCCAGCCTATCCA- 3′，下游引物：5′- GAG- CGTCTGATAGGACTCTG- 3′；CDC42上游引物：5′- G- ACAGATTACGACCGCTGAG- 3′，下游引物：5′- GGA- GTCTTTGGACAGTGGTG- 3′；RAC1上游引物：5′- CG- GTGAATCTGGGCTTATGG- 3′，下游引物：5′- GAGGT- TATATCCTTACCGTAC- 3′；RAC2上游引物：5′- CAG- CCAATGTGATGGTGGAC- 3′，下游引物：5′- GAGAAG-CAGATGAGGAAGAC- 3′；β- actin上游引物：5′- CAC- CATTGGCAATGAGCGGT- 3′，下游引物：5′- AGGTCT- TTGCGGATGTCCAC- 3′。具體步驟按試劑盒說明書進行。以β- actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA相對表達量。

1.3.3 細胞遷移相關分子啟動子區域轉錄因子ETS1結合位點分析 通過NCBI數據庫查詢遷移相關分子CDC42、RAC1和RAC2啟動子序列，并利用JASPAR數據庫分析各啟動子序列中可能的ETS1結合位點。

2 結果

2.1 各組細胞遷移能力比較 對照組、VEGF組、VEGF+欖香烯組細胞遷移數分別為(9.4±3.7)、(50.4±13.9)、(23.7±8.4)個。與對照組比較，VEGF組細胞遷移數明顯增多(P<0.05)；與VEGF組比較，VEGF+欖香烯組細胞遷移數明顯減少(P<0.05)。

2.2 各組細胞轉錄因子ETS1和遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表達比較 見表1。

表1 各組細胞轉錄因子ETS1和遷移相關分子CDC42、 RAC1、RAC2 mRNA相對表量達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與VEGF組比較，#P<0.05。

2.3 細胞遷移相關分子啟動子區域轉錄因子ETS1結合位點分析 細胞遷移相關分子CDC42、RAC1和RAC2啟動子序列中分別發現1、2、7個轉錄因子ETS1結合位點。見表2。

表2 細胞遷移相關分子CDC42、RAC1和RAC2啟動 子區域ETS1結合序列和位點分布

3 討論

中醫病機認為，瘀血阻滯是腫瘤的主要病因病機之一。中藥莪術能破血消積、行氣止痛，臨床廣泛用于治療腫瘤、慢性肝病等。β- 欖香烯是從中藥莪術中提取的一種倍半萜衍生物。我們前期研究發現，β- 欖香烯可上調Rho信號通路中的GDIβ表達，下調VGEF表達，從而抑制肝內微血管生成。同時有學者發現，β- 欖香烯能夠降低腫瘤細胞VEGF表達，抑制腫瘤血管新生。血管內皮細胞遷移是血管新生過程中的一個重要環節，β- 欖香烯是否通過影響血管內皮細胞遷移發揮抑制腫瘤血管新生的作用及其機制尚不明確。本研究我們利用VEGF刺激人臍靜脈內皮細胞遷移，發現轉錄因子ETS1以及RhoGTP酶家族遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表達均明顯升高；而β- 欖香烯干預能夠抑制VEGF誘導的EA.hy926細胞遷移，同時VEGF+欖香烯組轉錄因子ETS1和RhoGTP酶家族遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表達較VEGF組明顯降低。表明β- 欖香烯抑制VEGF誘導的EA.hy926細胞遷移效果是明確的。

VEGF作為一種主要的促血管生成因子，在腫瘤血管生成過程中具有重要作用[6～8]。VEGF能誘導血管內皮細胞向腫瘤組織方向遷移，也可作用于內皮細胞使轉錄因子ETS1表達升高，繼而促進內皮細胞遷移[9～12]。VEGF通過與其受體結合，引起受體自身磷酸化后，激活細胞內信號途徑介導的內皮細胞遷移，其中研究較為深入的是RhoGTP酶家族。RhoGTP酶家族在腫瘤細胞和內皮細胞中均有表達，其介導的血管內皮細胞遷移主要通過肌鈣蛋白的調節來實現，其家族主要成員包括CDC42、RAC1和RAC2。有研究表明，VEGF能誘導尿激酶型纖溶酶原激活物產生，使血管內皮細胞表達蛋白水解酶、基質金屬蛋白酶(MMPs)等，通過降解細胞外基質來促進血管內皮細胞遷移；還能作用于胞質中的轉錄因子(如ETS1)，影響其相應的靶基因，促進血管內皮細胞遷移[13]。本研究結果亦證實，VEGF刺激后EA.hy926細胞遷移能力增加，并可誘導轉錄因子ETS1和RhoGTP酶家族遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表達升高。

有研究發現，轉錄因子ETS1與腫瘤的侵襲和轉移有關[14,15]，其表達與VEGF、bFGF、MMPs等腫瘤生長、侵襲和轉移相關基因表達呈正相關關系。β- 欖香烯可抑制轉錄因子ETS1表達，從而影響下游靶基因的轉錄表達，繼而影響腫瘤血管生成。RhoGTP酶家族中CDC42活化導致細胞絲狀偽足形成，而RAC活化與運動細胞偽足有關。生物信息學分析顯示，這些RhoGTP酶家族基因啟動子區域均存在轉錄因子ETS1的結合位點，提示ETS1可能參與調控RhoGTP酶家族基因轉錄和表達，從而影響血管內皮細胞遷移。本研究結果顯示，β- 欖香烯亦能抑制RhoGTP酶家族遷移相關分子CDC42、RAC1、RAC2的表達。

綜上所述，β- 欖香烯可抑制轉錄因子ETS1表達，降低含ETS1結合位點的RhoGTP酶家族遷移相關分子CDC42、RAC1和RAC2啟動子區域活性及其轉錄表達，導致細胞絲狀偽足和運動偽足形成異常，繼而抑制血管內皮細胞遷移。ETS1可能是β- 欖香烯干預腫瘤血管新生的一個新靶點。

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湖北省自然科學基金資助項目(2015CB591)。

熊振芳(E- mail: xiong_zhenfang@126.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.008

R94

A

1002- 266X(2017)36- 0028- 03

2016- 07- 22)

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