血管內皮細胞敲除Rheb基因雜合子小鼠模型建立及意義

丁燕，賴麗芬,奈文青,單蘭蘭，陳順枝，吳洪淵，唐鈺，戴萌

(1南方醫科大學南方醫院，廣州510515；2湖南醫藥學院第一附屬醫院；3南方醫科大學武漢臨床醫學院)

血管內皮細胞敲除Rheb基因雜合子小鼠模型建立及意義

丁燕1,2,3，賴麗芬1,奈文青1,單蘭蘭1，陳順枝1，吳洪淵1，唐鈺1，戴萌1

(1南方醫科大學南方醫院，廣州510515；2湖南醫藥學院第一附屬醫院；3南方醫科大學武漢臨床醫學院)

目的建立血管內皮細胞敲除Rheb基因雜合子小鼠模型，旨在進一步研究Rheb基因在胚胎血管形成中的作用。方法將5只Rhebflox/flox雄鼠與15只Rhebflox/+雌鼠進行交配，共繁殖出子代小鼠76只(基因型為Rhebflox/flox或Rhebflox/+)。將76只子代小鼠與20只血管內皮細胞特異性表達Tek- Cre重組酶的小鼠(以下稱Cre小鼠)進行交配，得到基因型為Tek- Cre×Rhebflox/+及單純Rhebflox/+子代小鼠共140只。采用PCR法對140只小鼠鼠尾組織Rhebflox及Tek- Cre基因型進行鑒定，并記錄其2月齡體長及體質量；采用Western blotting法檢測Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠與單純Rhebflox/+小鼠肝組織Rheb蛋白表達。結果共得到基因型為Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠72只、單純Rhebflox/+小鼠68只，其體長分別為(18.50±0.13)、(18.80±0.10)cm，體質量分別為(29.50±0.15)、(30.10±0.21) g，二者比較P均>0.05；肝組織Rheb蛋白相對表達量分別為0.21±0.17、0.66±0.12，二者比較P<0.05。結論成功構建血管內皮細胞敲除Rheb基因雜合子小鼠模型，將為研究Rheb基因在胚胎血管形成中的作用奠定基礎。

基因敲除；Cre/LoxP條件性基因敲除技術；Rheb基因；雜合子；小鼠

mTOR信號激活是細胞生長、增殖及蛋白質翻譯和其他細胞代謝過程所必需的[1，2]。Rheb基因是mTOR信號激活的關鍵基因，并參與胚胎發育階段的血管構建，對血管系統的成熟和正常重建至關重要。研究報道，Rheb基因敲除與心血管疾病密切相關[3]，但Rheb基因敲除純合子小鼠有胚胎致死性[4]，且血管內皮細胞敲除TSC1、激活mTOR信號可導致胚胎血管生成缺陷[5]，說明Rheb基因對維持小鼠胚胎發育至關重要。目前國內外主要從分子和蛋白水平研究Rheb基因在胚胎血管形成中的作用[6]。2015年10月～2016年6月，本研究采用Cre/LoxP條件性基因敲除技術構建血管內皮細胞敲除Rheb基因的雜合子小鼠模型，旨在進一步研究Rheb基因在胚胎血管形成中的作用。

1 方法與結果

1.1 材料 實驗動物：血管內皮細胞特異性表達Tek- Cre重組酶的小鼠(以下稱Cre小鼠，基因型為Tek- Cre+/-雜合子)5只，購于美國Jackson實驗室[7]，4周齡，3雌2雄，體質量(14.50±0.13)g；Rhebflox/flox雄鼠5只，購于美國Jackson實驗室，4周齡，體質量(14.27±0.15)g；Rhebflox/+雌鼠15只，購于美國Jackson實驗室，4周齡，體質量(14.58±0.14)g；C57野生型小鼠10只，8雌2雄，4周齡，體質量(13.85±0.17)g。飼養及繁殖條件：將小鼠置于實驗中心潔凈的層流動物房內，室內溫度為25 ℃，濕度為50%～70%。主要試劑：DNTP試劑，購自美國Invitrogen公司；Tag酶購自寶生物工程(大連)有限公司，PCR引物均由上海英駿生物技術有限公司設計合成。

1.2 Rhebflox/flox純合子及Rhebflox/+雜合子小鼠養殖及基因型鑒定 將5只Rhebflox/flox雄鼠與15只Rhebflox/+雌鼠進行交配，順利繁殖出子代小鼠76只，毛發均為黑色。小鼠出生約1周，眼科剪剪取鼠尾約5 mm，采用PCR法進行基因型鑒定。方法如下：將鼠尾放入編好號碼的EP管中，加入100 μL裂解A液，10 000 r/min離心3 min；放入96 ℃金屬水浴鍋中，水煮1 h；再加入100 μL裂解B液，10 000 r/min離心3 min。PCR引物序列：上游引物：5′- GCCCAGAACATCTGTTCCAT- 3′，下游引物：5′- GGTACCCACAACCTGACACC- 3′。PCR反應體系共20 μL：2×PCR mix 10 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板4 μL，ddH2O 2 μL。PCR反應條件：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，58 ℃、1 min，72 ℃、1 min，循環35次；72 ℃、5 min，4 ℃保存。反應結束，將模板DNA取出，用微量移液槍取8 μL PCR產物，行瓊脂糖凝膠電泳，電泳產物在瓊脂糖凝膠成像系統拍照。Rhebflox/flox純合子小鼠可見850 bp條帶，野生型小鼠可見650 bp條帶，Rhebflox/+雜合子小鼠可見850、650 bp兩條條帶。其基因型鑒定結果見圖1。結果共繁殖出Rhebflox/flox純合子小鼠36只，Rhebflox/+雜合子小鼠40只。

注：1、2、3、5、6、9為Rhebflox/flox純合子；4、7、8、10為Rhebflox/+雜合子。

圖1小鼠Rhebflox基因型鑒定結果

1.3 Cre小鼠養殖及基因型鑒定 將5只Cre小鼠(毛發均為灰色)與10只C57野生型小鼠(毛發均為黑色)進行交配，順利繁殖出子代小鼠36只，其中灰色15只、黑色21只。參照1.2的方法進行Tek- Cre基因型鑒定。Tek- Cre引物序列：上游引物：5′- GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC- 3′，下游引物：5′- GTGAAACAGCATTGCTGCCACTT- 3′。PCR反應體系共20 μL：2×PCR mix 10 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板4 μL，ddH2O 2 μL。PCR反應條件：94 ℃、3 min，94 ℃、30 s，51.7 ℃、1 min，72 ℃、1 min，循環35次；72 ℃、2 min，4 ℃保存。參照1.2的方法進行瓊脂糖凝膠電泳，并于瓊脂糖凝膠成像系統拍照。其基因型鑒定結果見圖2。Cre小鼠可見100 bp條帶，野生型小鼠無此條帶。結果共繁殖出Cre小鼠20只。

注：1、2、5為Cre型；3、4、6、7、8、9、10 為野生型。

圖2小鼠Tek-Cre基因型鑒定結果

1.4 血管內皮細胞敲除Rheb基因雜合子小鼠養殖及基因型鑒定 將36只Rhebflox/flox小鼠、40只Rhebflox/+小鼠分別與20只Cre小鼠進行交配，得到基因型為Tek- Cre×Rhebflox/+的小鼠和單純Rhebflox/+小鼠共140只，其中基因型為Tek- Cre×Rhebflox/+的小鼠為本實驗所需建立的血管內皮細胞敲除Rheb基因雜合子小鼠。參照1.2、1.3的方法鑒定140只子代小鼠的Rhebflox及Tek- Cre基因型。結果顯示，基因型為Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠72只，單純Rhebflox/+小鼠68只。2月齡的Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠與單純Rhebflox/+小鼠體長分別為(18.50±0.13)、(18.80±0.10)cm，體質量分別為(29.50±0.15)、(30.10±0.21)g；二者體長、體質量比較P均>0.05。采用Western blotting法檢測Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠與單純Rhebflox/+小鼠肝組織Rheb蛋白表達。方法如下：取2月齡兩種小鼠各3只，處死后取適量肝組織，用解剖剪剪碎，蛋白裂解液充分裂解，自動研磨機充分研磨。100 ℃水浴10 min，調整樣品上樣量為10 μL，然后行SDS- PAGE，并將電泳產物轉印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，剪下相應條帶的PVDF膜，分別加入兔抗Rheb(1∶1 000)、鼠抗GAPDH(1∶5 000)，4 ℃搖床過夜。次日1×TBST洗膜3次，在辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG中室溫孵育1 h，1×TBST洗滌3次，暗室中曝光顯影。以GAPDH為內參，以Rheb蛋白電泳條帶灰度值與GAPDH蛋白電泳條帶灰度值的比值作為Rheb蛋白相對表達量。結果顯示，Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠與單純Rhebflox/+小鼠肝組織Rheb蛋白相對表達量分別為0.21±0.17、0.66±0.12，二者比較P<0.05；證實成功敲除了Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠的血管內皮細胞Rheb基因。見圖3。

注：KO為Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠，WT為單純Rhebflox/+小鼠。

圖3Tek-Cre×Rhebflox/+小鼠與單純Rhebflox/+小鼠肝組織Rheb蛋白表達電泳圖

2 討論

研究表明，Rheb基因缺失可引起血管炎癥反應加重，誘發微循環障礙[7～12]。心臟敲除Rheb基因的小鼠可出現各種心血管疾病[13]。目前對于Rheb基因作用的研究僅局限于細胞和分子水平[14]，關于血管內皮細胞敲除Rheb基因的小鼠模型研究較少，無法從動物整體水平分析Rheb基因在維持血管屏障功能中的作用[15]。mTOR信號與血管內皮損傷相關疾病密切相關[16]，在血管形成中發揮重要作用，而Rheb基因是mTOR信號激活的關鍵基因[17]。因此，構建僅在血管內皮細胞上敲除Rheb基因的小鼠模型對于進一步研究Rheb基因的功能極為重要。

研究證實，基因型為Rhebflox/+的雜合子小鼠血管內皮細胞及其組織中Rheb基因仍正常存在，這可能影響血管內皮細胞的功能[15]。根據Cre/LoxP條件性基因敲除技術原理，基因型為Tek- Cre×Rhebflox/+的小鼠血管內皮細胞Rheb基因被敲除，而其他細胞及組織內的Rheb基因仍可正常存在。因此，構建基因型為Tek- Cre×Rhebflox/+的雜合子小鼠對于進一步研究Rheb基因在微血管中的作用具有重要意義。本研究結果顯示，通過Cre/LoxP條件性基因敲除技術共繁殖出基因型為Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠72只、單純Rhebflox/+小鼠68只，二者體長及體質量比較差異無統計學意義，說明血管內皮細胞敲除Rheb基因對小鼠的體長和體質量沒有影響。Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠Cre基因鑒定結果可見100 bp條帶，證實其為Cre小鼠；Rhebflox基因鑒定結果可見850、650 bp兩條條帶，證實其為Rhebflox/+小鼠。上述結果證實基因型為Tek- Cre×Rhebflox/+的小鼠為本實驗所需建立的血管內皮細胞敲除Rheb基因雜合子小鼠。肝組織內富含血管，故本研究以肝組織為檢測標本。結果顯示，Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠肝組織Rheb蛋白相對表達量明顯低于單純Rhebflox/+小鼠，證實成功敲除了Tek- Cre×Rhebflox/+小鼠血管內皮細胞的Rheb基因。

綜上所述，本研究成功構建血管內皮細胞敲除Rheb基因的雜合子小鼠模型，并經基因型及蛋白水平驗證。本研究為進一步探討血管內皮細胞敲除Rheb基因在胚胎發育階段的血管構建及其對脈管系統成熟和正常重建過程中的作用奠定了基礎。

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廣州市科技計劃項目(2013J4500040)。

戴萌(E- mail： dm42298@163.com)

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1002- 266X(2017)36- 0034- 03

2016- 11- 25)