改良三甲散灌胃對老年性癡呆大鼠記憶能力及海馬組織Aβ、NGF表達的影響

馮麗謙，楊麗麗，高海婷，薛康麗，劉濤

(南京中醫藥大學，南京210023)

改良三甲散灌胃對老年性癡呆大鼠記憶能力及海馬組織Aβ、NGF表達的影響

馮麗謙，楊麗麗，高海婷，薛康麗，劉濤

(南京中醫藥大學，南京210023)

目的探討改良三甲散灌胃對老年性癡呆大鼠記憶能力及海馬組織β- 淀粉樣前體蛋白(Aβ)、神經生長因子(NGF)的影響。方法選擇SD大鼠72只，隨機分為假手術組、模型組、多奈哌齊組及三甲散高、中、低劑量組，每組12只。除假手術組外，其余各組建立老年性癡呆大鼠模型。多奈哌齊組建模后第1天開始予鹽酸多奈哌齊溶液0.21 mg/(mL·kg)灌胃，三甲散低、中、高劑量組建模后第1天開始分別予改良三甲散溶液1.25、2.5、5 g/(mL·kg)灌胃，模型組、假手術組同期予等體積生理鹽水灌胃，各組均連續灌胃15天。各組于灌胃第3、7、15天行跳臺實驗和水迷宮實驗，分別記錄潛伏時間及逃避潛伏時間。各組末次水迷宮實驗后，頸椎脫臼法處死，取海馬組織，制備組織切片，采用免疫組化法檢測海馬組織Aβ、NGF表達。結果灌胃第3、7、15天，模型組潛伏時間及逃避潛伏時間均長于假手術組(P均<0.05)。灌胃第7天，多奈哌齊組及三甲散高劑量組潛伏時間均短于模型組，三甲散高劑量組逃避潛伏時間短于模型組及三甲散低劑量組(P均<0.05)。灌胃第15天，多奈哌齊組及三甲散高、中、低劑量組潛伏時間均短于模型組，多奈哌齊組及三甲散高、中劑量組逃避潛伏時間均短于模型組，且三甲散高劑量組逃避潛伏時間縮短更明顯(P均<0.05)。模型組海馬組織Aβ表達高于假手術組，NGF表達低于假手術組(P均<0.05)。多奈哌齊組與三甲散中劑量組海馬組織Aβ表達均低于模型組及三甲散高、低劑量組，海馬組織NGF表達均高于模型組(P均<0.05)。結論改良三甲散灌胃可提高老年性癡呆大鼠的記憶能力，并具有劑量依賴性；其作用機制可能與降低海馬組織Aβ表達、提高NGF表達有關。

老年性癡呆；改良三甲散；中藥；β- 淀粉樣前體蛋白；神經生長因子；大鼠

老年性癡呆是一種以記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙以及人格、行為改變等為主要臨床表現的神經退化性疾病，其特征性病理改變是顳葉和海馬皮質等部位老年斑形成、神經元纖維纏結和神經元丟失[1，2]。改良三甲散是在《溫疫論》名方“三甲散”的基礎上加減優化而成的，方劑由龜板、鱉甲、首烏等藥物組成，具有滋陰潛陽、填精益髓、活血化瘀、祛痰化濁、搜絡開竅作用[3]。有研究證實，改良三甲散能改善老年性癡呆患者的記憶能力[4]。但目前對其作用機制尚不完全清楚。2016年3～10月，本研究觀察了改良三甲散對老年性癡呆大鼠記憶能力及海馬組織β- 淀粉樣前體蛋白(Aβ)、神經生長因子(NGF)表達的影響。現分析結果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠72只，SPF級，雌雄各半，體質量(220±20)g，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供。改良三甲散溶液，含生藥量1 g/mL，本院自制(龜甲、鱉甲、何首烏、石菖蒲各20 g，地鱉蟲、地龍各10 g，搗碎后加10倍純凈水煎煮0.5 h，過濾保存藥液；藥渣中加8倍純凈水煎煮0.5 h，過濾保存藥液；將兩次保存的藥液合并，濃縮至100 mL，4 ℃保存備用)。鹽酸多奈哌齊，江蘇豪森藥業股份有限公司；實驗前碾碎，生理鹽水溶解，制成濃度為0.04 mg/mL的鹽酸多奈哌齊溶液。β淀粉樣蛋白1- 42片斷(Aβ1- 42)、鵝膏蕈酸(Ibo)、硫磺素- T，美國Sigma公司；APP免疫組化試劑盒、NGF免疫組化試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組處理 所有大鼠適應性喂養1周，隨機分為假手術組、模型組、多奈哌齊組及三甲散低、中、高劑量組，每組12只。除假手術組外，其余各組參照劉濤等[5]的方法建立老年性癡呆大鼠模型。具體方法：大鼠腹腔注射D- 半乳糖50 mg/(kg·d)，連續30天；第31天腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后固定于腦立體定位儀上，沿顱骨正中線切開皮膚，暴露硬腦膜；根據大鼠腦立體定位圖譜[6]雙側定位，以前腦基底核水平為標準位，前囟中心為零點，前囟后3.3 mm、雙側旁開1.5 mm、深3.3 mm，微量進樣器自腦表面垂直進針，注射Aβ1- 42與Ibo的混合液2 μL(內含Aβ1- 42 5 μg、Ibo 5 μg)，分4次注射，20 min內注射完畢。假手術組開顱后注射等體積生理鹽水。多奈哌齊組建模后第1天開始予鹽酸多奈哌齊溶液0.21 mg/(mL·kg)灌胃，三甲散低、中、高劑量組建模后第1天開始分別予改良三甲散溶液1.25、2.5、5 g/(mL·kg)灌胃，模型組、假手術組同期予等體積生理鹽水灌胃，各組均連續灌胃15天。

1.3 大鼠記憶能力檢測 各組灌胃第3、7、15天進行跳臺實驗和水迷宮實驗。①跳臺實驗：跳臺底部為銅棒，可通電，跳臺內放置一塑料安全臺；預先將大鼠放入跳臺熟悉環境，然后通電刺激，電壓36 V，時間300 s；記錄大鼠從受到電刺激至第一次跳上塑料安全臺所需要的時間，即潛伏時間；實驗重復3次，取平均值。②水迷宮實驗：水迷宮分為四個象限，平臺高于水面1 cm，水溫(26±1)℃；記錄各組2 min內找到平臺的時間，即逃避潛伏時間；若2 min內未能找到平臺，則逃避潛伏時間記錄為2 min；實驗重復3次，取平均值。

1.4 大鼠海馬組織Aβ、NGF表達檢測 采用免疫組化法。各組末次水迷宮實驗后，頸椎脫臼法處死，開顱后取海馬組織。海馬組織經中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，4 μm厚切片。常規采用免疫組化法檢測海馬組織Aβ、NGF表達。所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。顯微鏡下隨機選取6個400倍視野，采用北航病理圖像分析軟件分析Aβ、NGF的光密度值，取其平均值作為海馬組織Aβ、NGF表達。

2 結果

2.1 各組記憶能力比較

2.1.1 跳臺實驗潛伏時間 灌胃第3、7、15天，模型組潛伏時間均長于假手術組(P均<0.05)。灌胃第7天，多奈哌齊組及三甲散高劑量組潛伏時間均短于模型組(P均<0.05)，三甲散中、低劑量組潛伏時間與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。灌胃第15天，三甲散高、中、低劑量組及多奈哌齊組潛伏時間均短于模型組(P均<0.05)，多奈哌齊組及三甲散高劑量組潛伏時間與假手術組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組跳臺實驗潛伏時間比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，△P<0.05。

2.1.2 水迷宮實驗逃避潛伏時間 灌胃3、7、15天，模型組逃避潛伏時間均長于假手術組(P均<0.05)。灌胃第7天，三甲散高劑量組逃避潛伏時間短于模型組及改良三甲散低劑量組(P均<0.05)。灌胃第15天，多奈哌齊組及三甲散高、中劑量組逃避潛伏時間均短于模型組，且改良三甲散高劑量組縮短更明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 各組水迷宮實驗逃避潛伏時間比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，△P<0.05；與三甲散高劑量組比較，▲P<0.05。

2.2 各組海馬組織Aβ及NGF表達比較 模型組海馬組織Aβ表達高于假手術組，NGF表達低于假手術組(P均<0.05)。多奈哌齊組與三甲散中劑量組海馬組織Aβ表達均低于模型組及三甲散高、低劑量組，海馬組織NGF表達均高于模型組(P均<0.05)。見表3。

3 討論

表3 各組海馬組織Aβ及NGF表達比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與多奈哌齊組比較，△P<0.05；與三甲散中劑量組比較，▲P<0.05。

老年性癡呆的中醫病理機制為腎虛髓空、痰瘀阻腦。Aβ是老年斑和淀粉樣蛋白沉積的主要成分，可引起氧化應激反應、線粒體損傷，引發神經毒性作用，導致神經細胞增殖障礙，同時可激活凋亡相關蛋白和因子，啟動細胞凋亡過程，引起癡呆相關的病理變化[7,8]；還可減少海馬和腦皮質等釋放乙酰膽堿，引起局灶性炎癥反應，加重癡呆病情[9, 10]。NGF是神經系統重要的生物活性分子之一，可促進神經元成熟并維持其生存和功能。在病理狀態下，NGF可降低缺血缺氧對神經元的損傷[11,12]。研究表明，NGF可增加腦組織膽堿能神經纖維數量，促進神經元損傷后恢復，改善老年性癡呆大鼠的學習記憶功能[13]。鹽酸多奈哌齊屬于膽堿酯酶抑制劑，是治療AD的常用藥物，能可逆性抑制乙酰膽堿酯酶引起的乙酰膽堿水解，增加受體部位的乙酰膽堿含量，繼而改善記憶能力。改良三甲散的主要功效為填補肝腎真陰、活血通經、化痰透竅，既有重濁滋陰藥，又有蟲類活血化瘀藥，寓補于通、寓通于滋、補而不膩、通而不破。本研究結果顯示，灌胃第7天，多奈哌齊組及三甲散高劑量組潛伏時間均短于模型組，三甲散高劑量組逃避潛伏時間短于模型組及三甲散低劑量組；灌胃第15天，多奈哌齊組及三甲散高、中、低劑量組潛伏時間均短于模型組，多奈哌齊組及三甲散高、中劑量組逃避潛伏時間均短于模型組，且三甲散高劑量組逃避潛伏時間縮短更明顯。表明改良三甲散灌胃可提高老年性癡呆大鼠的記憶能力，并具有劑量依賴性，且高劑量改良三甲散與鹽酸多奈哌齊的治療效果相當。

本研究結果顯示，模型組海馬組織Aβ表達高于假手術組，NGF表達低于假手術組；說明老年性癡呆大鼠海馬組織Aβ清除和代謝發生障礙，其神經毒性作用造成大腦海馬和皮質神經元損傷，而NGF表達降低造成腦組織某些神經胺類遞質的減少，從而影響中樞神經遞質的正常功能，導致神經細胞衰老、記憶能力減退。本研究多奈哌齊組與三甲散中劑量組海馬組織Aβ表達均低于模型組及三甲散高、低劑量組，海馬組織NGF表達均高于模型組；提示中劑量改良三甲散對Aβ、NGF表達的調節作用與鹽酸多奈哌齊相當。

綜上所述，改良三甲散灌胃可提高老年性癡呆大鼠的記憶能力，并具有劑量依賴性；其作用機制可能與降低海馬組織Aβ表達、提高NGF表達有關。但本研究結果在量效關系上并未完全同步，如中劑量改良三甲散在調控Aβ、NGF表達上效果最佳，而高劑量改良三甲散改善記憶能力效果更明顯，提示改良三甲散亦可能通過調控其他通路或蛋白表達而改善癡呆大鼠的記憶能力。

[1] Iwasaki Y, Deguchi A, Mori K, et al. An autopsy case of a centenarian with the pathology of senile dementia of the neurofibrillary tangle type[J]. Psychogeriatrics, 2016,17(2):126- 129.

[2] 金慧玲,張紅英.桃仁提取物對癡呆小鼠空間學習記憶和抗疲勞作用的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(16):285- 288.

[3] 劉學鳳,李義松,馮麗謙,等.改良三甲散對大鼠老年癡呆模型的影響[J].四川中醫,2013,31(1):56- 59.

[4] 劉濤,姜海英,董勤,等.“改良三甲散”含藥腦脊液對Аβ誘導的海馬神經元細胞損傷相關基因的影響[J].江蘇中醫藥,2010,42(10):72- 74.

[5] 劉濤,李義松,馮麗謙,等.老年性癡呆大鼠模型的研制[J].中華中醫藥學刊,2009,27(12):2515- 2517.

[6] 諸葛啟釧.大鼠腦立體定位圖譜[M].北京:人民衛生出版社,2005:23.

[7] Deng M, Huang L, Ning B, et al. beta- asarone improves learning and memory and reduces Acetyl Cholinesterase and Beta- amyloid 42 levels in APP/PS1 transgenic mice by regulating Beclin- 1- dependent autophagy[J]. Brain Res, 2016(1652):188- 194.

[8] Zhou Y, Zhang H, Liu L, et al. Fabrication of an antibody- aptamer sandwich assay for electrochemical evaluation of levels of beta- amyloid oligomers[J]. Sci Rep, 2016(6):35186.

[9] Gordon BA, Blazey T, Su Y, et al. Longitudinal beta- Amyloid Deposition and hippocampal volume in preclinical alzheimer disease and suspected Non- Alzheimer disease pathophysiology[J]. JAMA Neurol, 2016,73(10):1192- 1200.

[10] 張宣,吳紅彥,李海龍,等.microRNA表達對血管性癡呆的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2016,27(14):227- 230.

[11] Travaglia A, Pietropaolo A, Di Martino R, et al. A small linear peptide encompassing the NGF N- terminus partly mimics the biological activities of the entire neurotrophin in PC12 cells[J]. ACS Chem Neurosci, 2015,6(8):1379- 1392.

[12] Sari Y, Khalil A. Monoamine Oxidase inhibitors extracted from tobacco smoke as neuroprotective factors for potential treatment of Parkinson′s Disease[J]. CNS Neurol Disord Drug Targets, 2015,14(6):777- 785.

[13] Iulita MF, Do CS, Ower AK, et al. Nerve growth factor metabolic dysfunction in Down′s syndrome brains[J]. Brain, 2014,137(Pt 3):860- 872.

國家自然科學基金面上項目(81173313)。

劉濤(E- mail： 13952091103@139.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.011

R742

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1002- 266X(2017)36- 0037- 03

2017- 01- 24)