外源性甲狀腺素對胎兒酒精效果模型仔鼠生長及神經系統發育的影響

金文玉，金昭伶，金正勇，池永學，金福

(延邊大學附屬醫院，吉林延吉133000)

外源性甲狀腺素對胎兒酒精效果模型仔鼠生長及神經系統發育的影響

金文玉，金昭伶，金正勇，池永學，金福

(延邊大學附屬醫院，吉林延吉133000)

目的探討外源性甲狀腺素對胎兒酒精效果(FAE)模型仔鼠腦損傷的改善作用。方法取SD孕鼠18只，隨機分為對照組、模型組、治療組，每組6只。從受孕第6天開始至分娩，模型組、治療組每日攝取22%乙醇20 mL，對照組每日攝取與模型組相同熱卡、含8%糖的牛奶。各組分娩后保留仔鼠10只，并與母鼠分離，由代理母鼠養育。對照組、模型組仔鼠第1～10天每日頸后皮下注射生理鹽水2 μL/g，治療組仔鼠每日頸后皮下注射2.5 μg/mL L- 甲狀腺素2 μL/g。觀察各組仔鼠出生第7、14、21、28天體質量、血漿甲狀腺素水平、腦組織腦源性神經營養因子(BDNF)含量及BDNF陽性浦肯野細胞變化。結果治療組和對照組仔鼠出生各時間點體質量、血漿甲狀腺素水平及腦組織BDNF含量均明顯高于模型組同期(P均<0.01)，而治療組和對照組仔鼠出生各時間點比較P均>0.05。治療組和對照組仔鼠出生第7天開始小腦皮質中均可觀察到排列整齊的BDNF陽性浦肯野細胞，且出生第28天時治療組較對照組BDNF陽性浦肯野細胞數量更多，排列更整齊，突起更長，并可見部分分支。模型組各時間點均可觀察到延遲增長和分化的浦肯野細胞。結論外源性甲狀腺素可糾正FAE模型仔鼠的低甲狀腺素狀態，抑制BDNF陽性浦肯野細胞變性，改善FAE導致的神經系統發育障礙。

胎兒酒精效果；外源性甲狀腺素；腦源性神經營養因子；仔鼠

胎兒酒精綜合征(FAS)是指母孕期飲酒導致的子代認知行為異常、特征性顏面部畸形以及生長發育遲緩[1]。研究發現，部分母孕期飲用中等量乙醇并伴營養失調者子代雖無FAS的典型表現，但可出現行為和認識障礙為主要表現的胎兒酒精效果(FAE)，特別是胎兒腦發育關鍵時期連續飲酒數日，更容易引起FAE[2]，并將對胎兒造成伴隨終生的運動功能發育延遲，學習、記憶及言語困難[3]。甲狀腺素是維持機體正常生理功能和促進生長發育所必需的，在孕期對胎兒的腦發育具有重要作用。母孕期攝取乙醇可影響其子代甲狀腺的正常發育，繼而影響甲狀腺素分泌，影響胎兒腦細胞與腦組織構成；甲狀腺素缺乏時，甚至可導致胎兒腦組織蛋白合成障礙，與FAE的發生密切相關[4，5]。2014年10月～2016年4月，我們觀察了外源性甲狀腺素對FAE模型仔鼠腦組織腦源性神經營養因子(BDNF)表達的影響，旨在探討其對FAE腦損傷的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性SD大鼠36只、雄鼠12只，SPF級，12～13周齡，體質量230～250 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。RT- 2100C型酶聯免疫檢測儀，美國Rayto公司；羅氏Cobas E602型電化學發光分析儀，德國羅氏公司；L- 甲狀腺素、3′- DAB，美國Sigma公司；BDNF一抗，德國Chemicon公司；馬抗鼠二抗、ABC試劑盒，美國Vector公司；BDNF ELISA試劑盒，美國Promega公司。

1.2 FAE模型制備 將36只雌鼠與12只雄鼠按3∶1進行交配，以雌鼠陰道內發現栓塞之日作為受孕日，即受孕第0天。每只雌鼠受孕后單籠飼養。受孕第6天，隨機取18只孕鼠，隨機分為對照組、模型組、治療組，每組6只。剩余18只孕鼠作為代理母組，孕期正常飲水和攝食。三組出生仔鼠24 h內與母鼠分離，由代理母組養育。代理母組仔鼠處死。模型組：孕鼠從受孕第6天持續至分娩，每日攝取22%乙醇20 mL(熱量約為145 J)，制作FAE模型[6]；所生仔鼠出生1～10天每日頸后皮下注射生理鹽水2 μL/g。治療組：孕鼠處理同模型組，所生仔鼠出生1～10天每日頸后皮下注射2.5 μg/mL L- 甲狀腺素2 μL/g。對照組：孕鼠從受孕第6天持續至分娩，每日攝取與模型組同熱卡、含8%糖的牛奶35 mL；所生仔鼠出生1～10天每日頸后皮下注射生理鹽水2 μL/g。各組仔鼠出生24 h稱量體質量，淘汰體質量偏高或偏低仔鼠，每組保留10只仔鼠。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 仔鼠體質量 各組仔鼠分別于出生第7、14、21、28天，稱量并記錄其體質量。

1.3.2 血漿甲狀腺素水平 稱量體質量后，乙醚麻醉，心臟取血，4 ℃、3 000 r/min離心3 min，取血漿，-20 ℃冰箱保存。采用羅氏Cobas E602型電化學發光分析儀檢測血漿甲狀腺素。

1.3.3 腦組織BDNF蛋白含量 各組仔鼠心臟取血后處死，取相同部位腦組織約100 mg；充分剪碎后加入RIPA- PMSF(100∶1)，4 ℃充分勻漿，97 ℃水浴3 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃保存待測。采用ELISA法檢測腦組織BDNF蛋白含量。所有操作嚴格按BDNF ELISA試劑盒說明進行。

1.3.4 腦組織BDNF陽性浦肯野細胞形態及數量 各組仔鼠分別于出生第7、14、21、28天隨機取3只，麻醉后4%多聚甲醛心臟灌流，直至灌流液澄清；取腦組織，4%多聚甲醛固定，300 g/L蔗糖脫水24 h，常規冰凍切片，切片厚度35 μm；切片經PBS沖洗3 min×3次，含3% H2O2的PBS孵育30 min；PBS沖洗3 min×3次，5%馬血清室溫孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，BDNF一抗(1∶200)濕盒中室溫孵育1 h，4 ℃過夜；PBS沖洗5 min×5次，馬抗鼠二抗(1∶200)室溫孵育2 h；PBS沖洗5 min×5次；加入ABC復合物(1∶100)，室溫反應1 h；TBS沖洗3次，DAB染色5 min，PBS沖洗3 min×3次；常規脫水并封片，顯微鏡下觀察BDNF陽性浦肯野細胞形態及數量變化。

2 結果

2.1 各組仔鼠出生后體質量、血漿甲狀腺素水平及腦組織BDNF含量變化 見表1。

2.2 各組仔鼠出生后腦組織BDNF陽性浦肯野細胞形態及數量變化 見插頁Ⅱ圖6。出生第7天，模型組僅可少數淡染且輪廓不清的BDNF陽性浦肯野細胞，未見明顯突起；對照組可見數量較多的BDNF陽性浦肯野細胞，且能觀察到部分深入內顆粒層的BDNF陽性浦肯野細胞突起；治療組BDNF陽性浦肯野細胞數量少于對照組，但排列整齊，也可見部分突起。出生第14天，模型組雖可見大量BDNF陽性浦肯野細胞，但未成單層排列且未見明顯突起；對照組和治療組均可見呈單層排列且染色較強的BDNF陽性浦肯野細胞，細胞輪廓清晰，深入內顆粒層的細胞突起明顯。出生第21天，模型組可見單層排列不明顯的BDNF陽性浦肯野細胞，對照組和治療組BDNF陽性浦肯野細胞均呈明顯單層排列，并見深入內顆粒層的較長突起。出生第28天，模型組僅見極少量BDNF陽性浦肯野細胞，而對照組和治療組仍可見大量BDNF陽性浦肯野細胞，輪廓完整，呈規則單層排列，且治療組BDNF陽性浦肯野細胞數量更多、排列更整齊、突起更長，并可見部分分支。

表1 各組仔鼠出生后體質量、血漿甲狀腺素水平 及腦組織BDNF蛋白含量變化

注：與對照組同期比較，*P<0.01；與模型組同期比較，#P<0.01；與同組出生7天比較，△P<0.01；與同組出生14天比較，▲P<0.01；與同組出生21天比較，▽P<0.01。

3 討論

孕期飲用乙醇可引起母體下丘腦-垂體-甲狀腺軸紊亂，促甲狀腺激素受體功能失調，對促甲狀腺激素釋放激素出現鈍化反應，直接導致T3、T4水平下降，最終導致母體血液乃至子宮內低甲狀腺素狀態[7]。而甲狀腺素是胎兒早期腦發育的調控激素，特別是孕18～20周，胎兒甲狀腺發育尚不完全，此時神經元的遷徙以及宮內腦發育的其他關鍵因素在很大程度上取決于母體甲狀腺素的供應[8]。而孕期飲酒導致母體血液以及子宮內低甲狀腺素狀態會引起胎兒神經元遷徙延遲，發育受阻，對胎兒神經系統將造成不可逆損傷[9]。

本研究結果顯示，模型組仔鼠出生7、14、21、28天血漿甲狀腺素水平明顯低于對照組同期，提示胎兒期乙醇暴露確能導致仔鼠體內低甲狀腺素狀態。治療組仔鼠出生7天血漿甲狀腺素水平明顯高于模型組同期；治療組仔鼠出生14天血漿甲狀腺素水平與對照組相當，但明顯高于模型組；治療組仔鼠出生21天血液甲狀腺素水平低于出生14天，但仍明顯高于模型組，考慮為下丘腦負反饋調節所致；治療組仔鼠出生28天血漿甲狀腺素水平與對照組相當，但明顯高于模型組同期。提示外源性甲狀腺素可改善孕期飲酒導致的仔鼠低甲狀腺素狀態。

研究發現，出生或發育早期體內甲狀腺素水平降低可使動物神經系統功能、血液生化等多方面出現異常，如兒童最常見的內分泌疾病——克丁病，臨床表現為患兒身材矮小、發育遲緩等。本研究結果顯示，治療組和對照組各時間點體質量均明顯高于模型組，提示外源性甲狀腺素能促進孕期乙醇暴露仔鼠生長。

浦肯野細胞是小腦皮質5種神經元細胞中惟一的傳出神經元，在運動協調中起著至關重要的作用，且對內環境極其敏感[10]。BDNF為神經營養因子中的廣譜因子，是神經系統發展的調節器[11]。BDNF可促進周圍和中樞神經元存活、代謝、分化,并能修復損傷，最終促進受損神經元再生。研究發現，胎兒期乙醇暴露對仔鼠神經系統影響的直接后果是在特定區域和時間介導神經細胞凋亡和突觸受損，繼而抑制神經營養因子的表達和功能[12]；在乙醇誘導的神經毒性作用下，BDNF及其相關的信號傳導可發生急性耐受[13]，表明BDNF可用于治療神經退行性疾病[14]。本研究結果顯示，三組仔鼠出生7～28天腦組織BDNF蛋白含量均呈降低趨勢；模型組仔鼠出生7～28天腦組織BDNF蛋白含量均低于對照組和治療組同期，而治療組仔鼠出生7～28天腦組織BDNF蛋白含量雖低于對照組同期，但差異無統計學意義。提示外源性甲狀腺素可使治療組仔鼠腦組織BDNF蛋白合成增加。

研究發現，胎兒期乙醇暴露仔鼠腦組織中可觀察到細胞質延遲成熟的浦肯野細胞，而延遲成熟的浦肯野細胞產生的原因可能是由于乙醇和(或)其代謝產物的有害影響，也可能是由于血漿甲狀腺素水平降低所致[15]。本研究治療組和對照組仔鼠出生第7天小腦皮質中均可觀察到呈單層或多層排列且染色較強的BDNF陽性浦肯野細胞，細胞輪廓清晰，深入內顆粒層的細胞突起明顯；出生28天時治療組較對照組BDNF陽性浦肯野細胞數量更多，排列更整齊，突起更長，并可見部分分支；而模型組各時間點均可觀察到延遲增長和分化的浦肯野細胞。提示外源性甲狀腺素對FAS引起的腦損傷有改善作用。

綜上所述，外源性甲狀腺素可糾正胎兒期乙醇暴露仔鼠的低甲狀腺素狀態，抑制BDNF陽性浦肯野細胞變性，促進BDNF與其特異性受體結合，并加速其發育，使胎兒期乙醇暴露導致的神經系統損傷修復，最終促進受損神經元再生，繼而改善FAE引發的神經系統發育障礙。但這種改善是否能持續至成年期乃至老年期仍需進一步研究證實。

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