術后疼痛對大鼠認知功能障礙的影響及其機制

任建光，吳雅娟，王文軍

(儋州市人民醫院，海南儋州571799)

術后疼痛對大鼠認知功能障礙的影響及其機制

任建光，吳雅娟，王文軍

(儋州市人民醫院，海南儋州571799)

目的探討術后疼痛對大鼠認知功能障礙的影響及其機制。方法選擇SD大鼠80只，采用隨機數字表法分為模型組、對照組，每組40只。模型組右后足按Brennan法制作趾部切口疼痛模型，對照組僅麻醉，趾部不制作疼痛模型。模型組術后1(t1)、3(t2)、7(t3)、14天(t4)，對照組同時間，各隨機取10只，分別檢測右后足機械縮足閾值(MWT)、熱縮足潛伏期(TWL)，通過Morris水迷宮實驗檢測穿越平臺次數、平臺停留時間。檢測完上述指標，斷頭處死，取海馬區腦組織，采用Western blotting法檢測突觸后膜致密蛋白95(PSD95)、N- 甲基- D- 天冬氨酸受體2B亞型(NR2B)表達。結果模型組t1～t4MWT、TWL均低于對照組同期，穿越平臺次數、平臺停留時間均低于對照組同期，海馬區PSD95、NR2B相對表達量均低于對照組同期(P均<0.05)。結論術后疼痛可導致大鼠認知功能障礙發生,其機制可能與疼痛刺激使海馬區PSD95、NR2B表達降低有關。

認知功能障礙；疼痛；海馬區；突觸后膜致密蛋白95；N- 甲基- D- 天冬氨酸受體2B亞型；大鼠

術后認知功能障礙是患者全麻術后出現的一種中樞神經系統并發癥，多發生于老年人[1]。其發病機制至今仍不十分清楚。研究發現，人腦組織海馬區存在N- 甲基- D- 天冬氨酸(NMDA)受體，該受體可調節海馬神經元發育和突觸形成，在學習、記憶和認知過程中具有重要作用[2，3]。突觸后膜致密蛋白95(PSD95)可結合NMDA受體2B亞型(NR2B)形成突觸后膜蛋白復合物，在海馬回的突觸重塑過程中發揮重要作用[4]。2016年9月～2017年2月，本研究觀察術后疼痛對大鼠認知功能障礙的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠80只，SPF級，18月齡，體質量(400±30)g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016- 0002。所有大鼠單籠飼養，自由攝食飲水，室溫22～25 ℃，濕度55%～65%，12 h晝夜交替。Morris水迷宮系統，上海欣軟信息科技有限公司；電泳儀、轉膜儀，北京六一儀器廠；PL- 200熱刺痛儀，成都泰盟科技有限公司；Von Frey電子測痛儀，北京中昊萬通科技有限公司；酶標儀，上海一恒科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京碧云天生物科技有限公司；鼠抗PSD95、兔抗NR2B一抗，美國Sigma公司；鼠抗β- actin一抗、HRP標記的山羊抗鼠及山羊抗兔二抗，北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 動物分組及模型制備 所有大鼠適應性喂養1周，采用隨機數字表法分為模型組、對照組，每組40只。模型組右后足按Brennan法制作趾部切口疼痛模型。具體步驟：大鼠采用20%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，右后肢備皮，安爾碘消毒，鋪無菌洞巾，用15號刀片從足跟近端0.5 cm處向趾部作一長約1.0 cm的縱向切口，盡量避開血管以減少出血，逐層切開皮膚，分離筋膜和肌肉，用鑷子挑起足底肌肉，縱向切開，紗布按壓減少出血，用0號絲線縫合肌肉和皮膚，建模完成。整個手術過程不超過5 min。對照組同法麻醉，趾部不制作疼痛模型。兩組均于溫暖環境中自然蘇醒，避免強光和噪音刺激。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 機械縮足閾值(MWT)和熱縮足潛伏期(TWL) 模型組術后1、3、7、14天(分別記為t1、t2、t3、t4)，對照組同時間，各隨機取10只，檢測右后足MWT和TWL。所有大鼠置于Von Frey電子測痛儀或PL- 200熱刺痛儀上適應20 min，并排除光線、噪音、環境等干擾因素。MWT檢測：待大鼠安靜后，用Von Frey電子測痛儀的刺激針頭從篩網下方垂直刺激術側后爪中部，逐漸增加刺激強度，最大不超過40 g。大鼠出現逃避性抬足時的數值即為MWT。TWL檢測：將PL- 200熱刺痛儀置于大鼠術側足底中部，用紅外光近距離照射足底，照射時間最長15 s。從照射開始到大鼠出現逃避性抬腿的時間即為TWL。檢測時間為9：00～12：00。每只大鼠重復檢測5次，每次刺激間隔5 min，取其平均值。

1.3.2 穿越平臺次數及平臺停留時間 采用Morris水迷宮實驗。Morris水迷宮泳池分為四個象限，平臺位于其中一個象限中央。兩組均于術前進行為期5天的獲得性訓練。將大鼠頭朝向池壁輕輕放入水中，記錄大鼠水下找到平臺的時間，并讓其在平臺上停留30 s；若60 s內未能找到平臺，引導其上平臺并在平臺停留30 s。每天訓練4次，每次間隔大于30 min。兩組檢測完MWT、TWL后進行探查訓練。撤除Morris水迷宮平臺，將大鼠從原入水點的對側放入水中，并通過攝像系統記錄60 s內大鼠游過目標象限(原平臺所在象限)的次數(即穿越平臺次數)及時間(平臺所在象限停留時間)。

1.3.3 海馬區PSD95、NR2B表達 采用Western blotting法。各組完成Morris水迷宮實驗后，20%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，斷頭處死，迅速剝離枕骨和頂骨，完整取海馬區腦組織，- 80 ℃冰箱保存。所有腦組織收集完畢后置于蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑中，電動勻漿，室溫裂解30 min，4 ℃、13 000×g離心20 min，取上清液，BCA法進行蛋白定量后，加入5×上樣緩沖液，旋渦混勻，沸水浴變性10 min。取上樣蛋白20 μg，行SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳，當目的蛋白跑至凝膠底部時停止電泳，并轉印至PVDF膜；封閉液封閉，然后分別加入鼠抗PSD95(1∶500)、兔抗NR2B(1∶500)、鼠抗β- actin(1∶2 000)一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜10 min×3次，加入 HRP標記的山羊抗鼠(1∶2 000)或山羊抗兔(1∶2 000)二抗，37 ℃孵育1 h；TBST洗膜10 min×3次，ECL發光，暗室顯影、定影，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β- actin內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與β- actin蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 兩組MWT、TWL比較 見表1。

2.2 兩組穿越平臺次數、平臺停留時間比較 見表2。

2.3 兩組海馬區PSD95、NR2B表達比較 見表3。

3 討論

表1 兩組各時點MWT、TWL比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05；與同組t1時比較，#P<0.05；與同組t2時比較，△P<0.05；與同組t3時比較，▲P<0.05。

表2 兩組各時點穿越平臺次數、平臺停留時間比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05；與同組t1時比較，#P<0.05；與同組t2時比較，△P<0.05。

表3 兩組各時點海馬區PSD95、NR2B 相對表達量比較

注：與對照組同期比較，*P<0.05；與同組t1時比較，#P<0.05；與同組t2時比較，△P<0.05；與同組t3時比較，▲P<0.05。

POCD是全麻術后出現的中樞神經系統并發癥，主要表現為精神錯亂、焦慮、人格改變以及記憶受損等，是老年人術后常見的并發癥之一，可導致患者生活質量下降、住院時間延長、醫療成本增加、病死亡率升高等[5]。隨著我國人口老齡化加劇，老年人因各種疾病入院接受全麻手術者逐漸增多，POCD的發生率亦逐漸升高。目前，對POCD產生的原因主要考慮麻醉藥物、患者年齡等因素，而對手術本身疼痛刺激的研究較少。

術后持續性疼痛是臨床上常見的一種病理性疼痛，一般認為是由傷害感受器持續性興奮而引發的中樞敏感化而致。研究發現，手術相關的傷害性刺激可促進POCD的發生，傷害性刺激后的痛覺過敏也與POCD密切相關[6，7]。本研究模型組按Brennan法制作大鼠趾部切口疼痛模型，對照組僅麻醉，不作趾部切口疼痛模型，觀察兩組疼痛敏感性變化；結果發現，模型組術后1～14天MWT、TWL均明顯降低，表明趾部切口手術可誘發術后痛覺過敏現象。本研究通過Morris水迷宮實驗評價小鼠學習記憶能力，結果發現，在傷害性刺激存續期間，模型組穿越平臺次數較對照組明顯減少，平臺停留時間較對照組明顯縮短，說明模型組已經出現了認知功能障礙，且可能與手術傷害性刺激有關。

NMDA受體廣泛分布于哺乳動物的中樞神經系統中，并與突觸可塑性及神經興奮性毒性密切相關。NMDA受體分為NR1、NR2和NR3三種亞單位，其中NR2亞單位中的NR2B亞基在中樞痛敏的形成和神經系統的學習記憶突觸機制中至關重要[8，9]。手術相關的傷害性刺激能阻斷NMDA受體，抑制突觸前膜谷氨酸的釋放，使大腦神經元發生退行性病變[10]。NR2B亞基在脊髓以上大腦皮層密度最高。有研究表明，存在認知功能障礙的動物可出現與認知相關的腦區皮層重排[11]，如內側前額葉、前扣帶回和海馬區等，這可能是出現認知功能障礙的基礎。海馬作為情緒、學習和記憶中樞，在工作記憶、情感記憶及注意力調節等腦功能中發揮重要作用[12]。有研究發現，疼痛模型大鼠的認知功能減退與海馬-前額葉皮層的通路結構連接減少有關。Qiu等[13]研究發現，海馬區NMDA受體NR2B亞基有助于海馬神經元發育和突觸形成。PSD95是一種突觸后膜標記物，可代表突觸的形態和密度。有研究發現，PSD95表達降低與突觸數量減少或突觸丟失以及學習和記憶功能損害有關[14]。NMDA受體活性受PSD95蛋白家族調節，PSD95本身沒有蛋白酶活性，但可結合NMDA受體亞基NR2B，形成PSD95/NR2B復合物，參與NMDA受體介導的突觸信號傳遞和突觸可塑性調節等[15]。闞紅軍等[16]研究發現，神經病理性疼痛可引起依賴于NMDA受體的PSD95重新分布，而大鼠出現空間記憶障礙與內側前額葉部位突觸小體PSD95的重塑有關。本研究模型組海馬區各時間點PSD95、NR2B相對表達量均低于對照組，說明術后疼痛刺激能夠抑制海馬區突觸重塑，且可阻斷NMDA受體，抑制突觸前膜谷氨酸釋放，增加神經興奮性毒性，與上述觀點基本一致。

綜上所述，術后疼痛可致大鼠認知功能障礙發生，其機制可能與疼痛刺激使海馬區PSD95、NR2B表達降低有關。本研究為海馬區PSD95、NR2B有可能作為術后認知功能障礙的治療靶點提供了理論基礎。

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