結直腸癌組織Ephrin B2表達變化及其對上皮間質轉化的影響

張旭，陳秀，陳旺盛

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

結直腸癌組織Ephrin B2表達變化及其對上皮間質轉化的影響

張旭，陳秀，陳旺盛

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

目的探討結直腸癌組織肝配蛋白B2(Ephrin B2)表達變化及其對上皮間質轉化(EMT)的影響。方法選擇結直腸癌組織、癌旁組織及正常結直腸組織各45例份，采用qRT- PCR法、Western blotting法檢測Ephrin B2 mRNA和蛋白表達。采用免疫組化法檢測Ephrin B2蛋白及EMT標記物N- cadherin、Vimentin、E- cadherin蛋白陽性表達。分析Ephrin B2蛋白陽性表達與結直腸癌患者臨床病理參數的關系及其與N- cadherin、Vimentin、E- cadherin蛋白陽性表達的關系。結果結直腸癌組織及癌旁組織Ephrin B2 mRNA和蛋白相對表達量均高于正常結直腸組織(P均<0.05)；結直腸癌組織Ephrin B2 mRNA及蛋白相對表達量與癌旁組織比較差異無統計學意義(P均>0.05)。Ephrin B2蛋白陽性表達與結直腸癌患者性別、年齡無關(P均>0.05)，與腫瘤臨床分期、組織分化程度、淋巴結轉移及遠處轉移有關(P均<0.05)。結直腸癌組織Ephrin B2蛋白陽性表達與E- cadherin蛋白陽性表達呈負相關關系(r=-0.216，P<0.05)，與N- cadherin、Vimentin蛋白陽性表達均呈正相關關系(r分別為0.401、0.379，P均<0.05)。結論結直腸癌組織中Ephrin B2高表達，其表達變化能促進EMT，增強腫瘤的侵襲、轉移能力。

結直腸癌；肝配蛋白B2；上皮間質轉化；腫瘤侵襲；腫瘤轉移

結直腸癌的發生、發展是一個多基因、多階段的演變過程，細胞惡變首先是分子水平的改變[1，2]。因此，尋找結直腸癌的特異性分子生物學標志物對早期診斷和靶向治療意義重大。但目前對結直腸癌早期診斷缺乏特異性分子生物學標志物。產生促紅細胞生成素的肝細胞受體(EPH)家族是酪氨酸蛋白激酶受體家族(RTKs)中最大的一個亞族，在腫瘤侵襲和轉移中發揮重要作用。EPH家族包括受體Eph及配體肝配蛋白(Ephrin)兩部分，肝配蛋白B2(Ephrin B2)是配體Ephrin的亞型之一，已被證實與結直腸癌的發生有關[3]。上皮間質轉化(EMT)是指上皮細胞獲得間質細胞表型的生物學過程，這個過程是可逆的[4，5]。近年研究證實，在上皮來源的惡性腫瘤中EMT發揮了至關重要的作用，與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[6，7]。但目前關于Ephrin B2與EMT在結直腸癌中的關系鮮見報道。2015年9月～2016年9月，我們觀察了結直腸癌組織中Ephrin B2表達變化，現分析結果并探討其對EMT的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期于西南醫科大學附屬醫院行手術治療的結直腸癌患者45例，男29例、女16例，年齡45～70歲、平均55歲。所有患者術前未接受新輔助化療或其他治療，術后經組織病理檢查明確診斷。排除術前接受過抗腫瘤治療者，無法手術或手術無法切除者。臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期17例，Ⅲ、Ⅳ期28例；組織分化程度：低分化29例，中高分化16例；有淋巴結轉移31例，有遠處轉移9例。

1.2 結直腸癌組織、癌旁組織及正常結直腸組織Ephrin B2表達檢測 取手術切除的結直腸癌組織、癌旁組織(距腫瘤組織邊緣≤2 cm)及正常結直腸組織各45例份，迅速置于液氮中，- 80 ℃冰箱保存備用。①Ephrin B2 mRNA表達：采用qRT- PCR法。采用TRIzol法提取各組織總RNA，蛋白核酸分析儀檢測總RNA純度，OD260/OD280為1.8～2.0。取0.8 μg總RNA，按PCR逆轉錄試劑盒說明逆轉錄為cDNA，然后進行PCR擴增。引物設計由華大基因設計合成。引物序列：Ephrin B2上游引物：5′- CGATTGAGCCTTACGACAC- 3′，下游引物：5′- TTTTAAGCGCTGAGCATTG- 3′，片段大小256 bp；GAPDH上游引物： 5′- TGACTTCAACAGCGACACCC-A- 3′，下游引物：5′- CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA- 3′，片段大小102 bp。PCR擴增體系共25 μL：ddH2O 8.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，SYBR Green Mix Taq 12.5 μL；反應條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s共40個循環，然后65 ℃ 5 s、95 ℃ 5 min。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算Ephrin B2 mRNA相對表達量。實驗重復3次，取平均值。②Ephrin B2蛋白表達：采用Western blotting法。按全蛋白提取試劑盒說明提取組織中總蛋白，BCA法蛋白定量后，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，使其充分變性。取40 μg蛋白行SDS- PAGE(5%濃縮膠+12%分離膠)，濃縮膠電泳電壓80 V、分離膠電泳電壓100 V，當Marker藍色條帶跑至電泳槽底部時停止電泳。按濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜(恒流：250 mA，時間：1 kd/min)。取出PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入GAPDH(1∶5 000)、Ephrin B2一抗(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次，避光條件下二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL顯影，采用ChimiDox- XR凝膠成像儀對蛋白電泳條帶進行灰度掃描，Quantity One軟件分析蛋白電泳條帶的灰度值。以Ephrin B2蛋白電泳條帶灰度值/GAPDH蛋白電泳條帶灰度值作為Ephrin B2蛋白相對表達量。分析Ephrin B2蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理參數的關系。

1.3 結直腸癌組織Ephrin B2、N- cadherin、E- cadherin、Vimentin蛋白陽性表達檢測 采用免疫組化法。取結直腸癌組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。切片經二甲苯脫臘、梯度乙醇脫水，PBS沖洗5 min×3次；0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液抗原熱修復，內源性過氧化物酶37 ℃封閉20 min；PBS沖洗5 min×3次，一抗[Ephrin B2(稀釋倍數1∶200)，N- cadherin、Vimentin、E- cadherin(稀釋倍數1∶250)]4 ℃孵育過夜；室溫復溫30 min，PBS沖洗5 min×3次，HRP標記的二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照觀察。Ephrin B2、N- cadherin蛋白陽性染色定位于細胞膜和細胞質，Vimentin蛋白陽性染色定位于細胞質，E- cadherin蛋白陽性染色定位于細胞膜，均呈黃色或褐色顆粒。在陽性細胞最多的區域選擇5個400倍視野，計數不少于100個細胞，觀察細胞著色強度，計算陽性細胞所占比例。細胞著色強度：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞所占比例：≤5%為0分，>5%～≤25%為1分，>25%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分。根據細胞著色強度和陽性細胞所占比例綜合判定，二者乘積≥3分為陽性。所有結果由兩位病理醫師分別評價，取二者平均值。分析Ephrin B2蛋白陽性表達與E- cadherin、N- cadherin、Vimentin蛋白陽性表達的關系。

2 結果

2.1 結直腸癌組織、癌旁組織及正常結直腸組織Ephrin B2表達比較 見表1。

表1 結直腸癌組織、癌旁組織及正常結直腸組織Ephrin B2 mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與正常結直腸組織比較，*P<0.05。

2.2 Ephrin B2蛋白陽性表達與結直腸癌患者臨床病理參數的關系 見表2。

表2 Ephrin B2蛋白陽性表達與結直腸癌患者 臨床病理參數的關系[例(%)]

2.3 結直腸癌組織Ephrin B2蛋白陽性表達與E- cadherin、N- cadherin、Vimentin蛋白陽性表達的關系 結直腸癌組織Ephrin B2、E- cadherin、N- cadherin、Vimentin蛋白陽性表達率分別為55.6%(25/45)、33.3%(15/45)、51.1%(23/45)、62.2%(28/45)。Ephrin B2蛋白陽性表達與E- cadherin蛋白陽性表達呈負相關關系(r=-0.216，P<0.05)，與N- cadherin、Vimentin蛋白陽性表達均呈正相關關系(r分別為0.401、0.379，P均<0.05)。見表3。

表3 結直腸癌組織Ephrin B2蛋白陽性表達與E- cadherin、N- cadherin、Vimentin蛋白陽性表達的關系(例)

3 討論

EPH家族受體Eph及其配體Ephrin均可分為兩大類，即Eph A1～Eph A10、Eph B1～Eph B6和Ephrin A1～Ephrin A6、Ephrin B1～Ephrin B3[8]。EPH家族均為跨膜蛋白，包含相對保守的胞內區、跨膜區、胞外區三部分，其活化依賴細胞間緊密連接。Ephrin配體嵌合在細胞膜中并與特定細胞的Eph受體結合才能發揮作用[9]。研究發現，Ephrin B2與其介導的受體Eph B4形成特有的雙向信號傳導系統，在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[10，11]。在許多惡性腫瘤組織中，Ephrin B2高表達，如食管癌[12]、乳腺癌[13]、卵巢癌[14]，而在正常組織中低表達或不表達。有研究表明，Ephrin B2在細胞癌變過程中發揮重要作用。Ephrin B2不僅參與惡性腫瘤的發生過程，還與惡性腫瘤的侵襲、轉移過程密切相關[15]。提示Ephrin B2可能是良性腫瘤惡變過程中的早期作用因子，并在腫瘤發生、發展和侵襲、轉移過程中具有積極作用。但目前鮮見Ephrin B2與結直腸癌關系的報道。

本研究結果顯示，結直腸癌組織及癌旁組織Ephrin B2 mRNA及蛋白相對表達量均高于正常結直腸組織；結直腸癌組織Ephrin B2 mRNA及蛋白相對表達量雖高于癌旁組織，但差異無統計學意義。提示Ephrin B2可能在結直腸癌的發生、發展過程中發揮重要作用，有可能作為結直腸癌早期診斷的分子生物學標志物。本研究還發現，Ephrin B2蛋白陽性表達與患者性別、年齡無關，與腫瘤臨床分期、組織分化程度、淋巴結轉移及遠處轉移有關。說明Ephrin B2在促進結直腸癌侵襲和轉移方面可能發揮積極作用。但目前關于Ephrin B2在結直腸癌侵襲和轉移中的作用機制研究甚少。

研究證實，在腫瘤的侵襲和轉移過程中EMT發揮關鍵作用。EMT使具有極性的、相對穩定的上皮細胞，通過一系列的生化過程獲得間質細胞表型，從而提高腫瘤細胞的侵襲和遷移能力[16]。間質細胞標志分子N- cadherin、Vimentin上調，而上皮細胞標志分子E- cadherin缺失或下調，與EMT密切相關，被認為是腫瘤細胞侵襲和遷移能力增強的標志[17]。目前關于Eph- Ephrin系統在惡性腫瘤侵襲、轉移中的作用越來越受到關注[18～20]。研究發現，Ephrin B2能夠增強細胞在細胞外基質的游走能力，繼而促進腫瘤細胞的擴散和轉移[21]；Eph A2可能通過促進EMT在胃癌的發生、發展過程中發揮重要作用[22]。本研究結果顯示，Ephrin B2蛋白陽性表達與E- cadherin蛋白陽性表達呈負相關關系，與Vimentin、N- cadherin蛋白陽性表達呈正相關關系。提示Ephrin B2可能通過調控N- cadherin、E- cadherin、Vimentin表達，促進EMT進程，參與結直腸癌的侵襲和轉移。

綜上所述，結直腸癌組織Ephrin B2高表達，其表達變化能促進EMT進程，增強腫瘤的侵襲和轉移能力。Ephrin B2有可能作為結直腸癌早期診斷、分子靶向治療及預后判斷的分子生物學標志。Ephrin B2及其配體形成的雙向信號傳導系統對腫瘤調控的機制相當復雜，可能在同一種腫瘤中發揮致癌和抑癌雙重作用，故其在結直腸癌中的作用及其與EMT的關系尚需進一步研究。

[1] Siegel RL, Miller KD, Jemaal A. Cancer statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(1):7- 30.

[2] 李道娟，李倩，賀宇彤.結直腸癌流行病學趨勢[J].腫瘤防治研究，2015，42(3)：305- 310.

[3] Li P, Chen W, Wang Y, et al. Effects of ephrinB2 gene siRNA on the biological behavior of human colorectal cancer cells[J]. Oncol Rep, 2015,33(2):758- 766.

[4] Lee MH, Kachroo P, Pagano PC, et al. Combination treatment with apricoxib and IL- 27 enhances inhibition of epithelial- mesenchymal transition in human lung cancer cells through a STAT1 dominant pathway[J]. J Cancer Sci Ther, 2014,6(11):468- 477.

[5] 陳文浩，楊明，張艷橋.上皮-間質轉化在惡性腫瘤中發生機制的研究進展[J].中國腫瘤，2016，25(1)：51- 57.

[6] 李倩，徐春燕，彭鵬，等.姜黃素對TNF- α誘導人結直腸癌細胞上皮間充質轉化、遷移的影響[J].山東醫藥，2016，56(34)：1- 3.

[7] Shao S, Zhao X, Zhang X, et al. Notch1 signaling regulates the epithelial- mesenchymal transition and invasion of breast cancer in a slug- dependent manner[J]. Mol Cancer, 2015(14):28.

[8] Salvucci O, Tosato G. Essential roles of EphB receptors and EphrinB ligands in endothelial cell function and angiogenesis[J]. Adv Cancer Res, 2012(114):21- 57.

[9] Mosch B, Reissenweber B, Neuber C, et al. Eph receptors and Ephrin ligands: important players in angiogenesis and tumor angiogenesis[J]. J Oncol, 2010,2010:135285.

[10] Herath NI, Spanevello MD, Doecke JD, et al. Complex expression patterns of Eph receptor tyrosine kinases and their ephrin ligands in colorectal carcinogenesis[J]. Eur J Cancer, 2012,48(5):753- 762.

[11] 劉成霞，劉海燕，李學峰，等.鋸齒狀息肉癌變途徑中Eph B2及Ephrin B2的表達及作用[J].世界華人消化雜志，2014，22(31)：4872- 4877.

[12] 鄭慶豐，柳碩巖，王海燕，等.Eph B4及其配體Ephrin B2在食管鱗癌中表達及其與血管生成的關系[J].中國腫瘤臨床，2013，40(10)：579- 582.

[13] 趙薇，馬沖.Ephrin- B2在乳腺癌組織中的表達及臨床意義[J].牡丹江醫學院學報，2012，33(6)：3- 5.

[14] Alam SM, Fujimoto J, Jahan I, et al. Coexpression of EphB4 and ephrinB2 in tumor advancement of ovarian cancer[J]. Br J Cancer, 2008,98(4):845- 851.

[15] Zhang R, Zhao Y, Zhang S, et al. The expressions of EphrinB2 and VEGF in nasopharyngeal carcinoma and their clinical significance[J]. Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi, 2013,27(4):178- 180.

[16] Zhu QC, Gao RY, Wu W, et al. Epithelial- mesenchymal transition and its role in the pathogenesis of colorectal cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013,14(5):2689- 2698.

[17] Ficher KR, Durrans A, Lee S, et al. Epithelial- to- mesenchymal transition is not required for lung metastasis but contributes to chemoresistance[J]. Nature, 2015,527(7579):472- 476.

[18] 傅明杰，邢雪.Eph受體家族與腫瘤及腫瘤血管的相關性研究進展[J].臨床普外科電子雜志，2014，2(2)：53- 58.

[19] 徐華林，趙娟娟，鄭文，等.Eph及其配體Ephrin在腫瘤轉移中的研究進展[J].腫瘤，2016，35(6)：707- 712.

[20] 錢光，梅炯，蔡宣松.Eph- ephrin系統與腫瘤的血管生成[J].同濟大學學報(醫學版)，2004，25(5)：431- 433.

[21] Meyer S, Hafner C, Guba M, et al. Ephrin- B2 overexpression enhances integrin- mediated ECM- attachment and migration of B16 melanoma cells[J]. Int J Oncol, 2005,27(5):1197- 1206.

[22] Hou F, Yuan W, Huang J, et al. Overexpression of EphA2 correlates with epithelial- mesenchymal transition- related proteins in gastric cancer and their prognostic importance for postoperative patients[J]. Med Oncol, 2012,29(4):2691- 2700.

西南醫科大學青年基金資助項目(2014QN088)。

陳旺盛(E- mail: wangzhai_147@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.021

R735.3

B

1002- 266X(2017)36- 0065- 04

2017- 01- 15)