肺鱗癌組織miR- 146a表達變化及其對細胞遷移和侵襲的影響

王金蘭，譚音玲，郭麗艷

(濰坊醫學院附屬益都中心醫院，山東濰坊262500)

肺鱗癌組織miR- 146a表達變化及其對細胞遷移和侵襲的影響

王金蘭，譚音玲，郭麗艷

(濰坊醫學院附屬益都中心醫院，山東濰坊262500)

目的探討miR- 146a在肺鱗癌發生、發展中的作用。方法采用qRT- PCR法檢測70例份肺鱗癌組織及其配對的癌旁正常組織、20例份正常肺組織miR- 146a表達，并分析miR- 146a表達與肺鱗癌患者臨床病理參數的關系。篩選人肺鱗癌細胞SK- MES- 1、NCI- H520、NCI- H2170、NCI- H226及正常肺組織上皮細胞(BEAS- 2B)中miR- 146a表達最低的NCI- H520細胞進行后續實驗。采用脂質體介導法轉染miR- 146a mimics或陰性對照mimics- NC，Transwell小室法檢測轉染miR- 146a mimics和陰性對照mimics- NC的NCI- H520細胞遷移和侵襲能力。結果肺鱗癌組織miR- 146a表達明顯低于癌旁正常組織和正常肺組織(P均<0.01)。肺鱗癌組織miR- 146a表達與腫瘤組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移有關(P均<0.01)。轉染miR- 146a mimics的NCI- H520細胞遷移和侵襲細胞數目較轉染mimics- NC的NCI- H520細胞明顯降低(P<0.05或<0.01)。結論肺鱗癌組織miR- 146a表達降低，其表達變化與腫瘤的惡性生物學行為有關；miR- 146a能夠明顯抑制肺鱗癌細胞的遷移和侵襲。

肺鱗狀細胞癌；微小RNA- 146a；細胞侵襲；細胞遷移

在肺癌的常見病理類型中，肺鱗癌的發病率僅次于肺腺癌,近年來其發病率有明顯上升趨勢[1～3]。目前針對驅動基因的分子靶向治療，如EGFR酪氨酸激酶抑制劑[4]、EML4- ALK融合基因抑制劑[5]等，主要用于治療肺腺癌，關于肺鱗癌靶向治療的研究較少且進展緩慢[6]。因此，尋找肺鱗癌敏感、特異的分子靶點及分子生物學標志物迫在眉睫。微小RNA(miRNA)是一類長度為17～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，可通過與靶基因mRNA的3′非編碼區結合，降解mRNA，在轉錄后水平調節靶基因表達，進而參與機體炎癥反應、免疫應答及細胞生長等病理生理過程[7，8]。據報道，miRNA雖然僅占所有基因的1%～5%，卻參與人類約1/3蛋白編碼基因的表達調控[9]。miRNA在惡性腫瘤的發生、發展過程中具有癌基因或抑癌基因作用。miR- 146a是首個被發現具有免疫調節作用的miRNA，在機體炎癥反應及自身免疫性疾病的發生中具有重要作用[10,11]。近年研究發現，miR- 146a與惡性腫瘤的發生、發展亦具有一定關系。Kumaraswamy等[12]研究發現，乳腺癌組織miR- 146a低表達與腫瘤進展及患者預后不良有關；Hou等[13]研究發現，miR- 146a能抑制胃癌細胞的侵襲及遷移。但miR- 146a在肺鱗癌組織中的表達及其對肺鱗癌細胞侵襲和遷移的影響目前尚不清楚。本研究探討miR- 146a在肺鱗癌組織中的表達及其對肺鱗癌細胞遷移和侵襲的影響。現分析結果并報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年10月～2015年10月濰坊醫學院附屬益都中心醫院手術切除的新鮮肺鱗癌組織及其配對的癌旁正常組織(距癌組織邊緣≥5 cm)各70例份，均經組織病理檢查明確診斷。標本來源患者男48例、女22例，年齡(58±7)歲；腫瘤最大直徑：≤2 cm者24例，>2 cm者46例；組織分化程度：低分化20例，中高分化50例；臨床分期(參照2009年第7版國際抗癌聯盟肺癌TNM分期標準)：Ⅰ、Ⅱ期31例，Ⅲ期39例；有淋巴結轉移30例，無淋巴轉移40例；有吸煙史者53例，無吸煙史者17例。所有患者術前未行任何抗腫瘤治療，亦未合并其他器官或組織惡性腫瘤。同期收集因外傷、咯血等肺良性疾病行肺葉切除的正常肺組織標本20例份，標本來源患者性別、年齡等一般資料與肺鱗癌患者匹配。

1.2 組織miR- 146a表達檢測 采用qRT- PCR法。取肺鱗癌組織及其配對的癌旁正常組織、正常肺組織標本，采用TRIzol法提取組織總RNA，分光光度計檢測總RNA純度，OD260/OD280為1.8～2.0。按RNA逆轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA，然后進行PCR擴增。引物設計：miR- 146a上游引物：5′- GGGTGAGAACTGAATTCCA- 3′，下游引物：5′- CAGTGCGTGTCGTGGAGT- 3′。按PCR試劑盒說明配置PCR反應體系。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR- 146a相對表達量。實驗重復3次，取平均值。比較不同組織miR- 146a表達，并分析肺鱗癌組織miR- 146a表達與患者臨床病理參數的關系。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞實驗材料 人肺鱗癌細胞系(SK- MES- 1，NCI- H520，NCI- H2170，NCI- H226)、正常肺組織上皮細胞(BEAS- 2B)，美國ATCC公司。高糖DMEM培養基，美國Hyclone公司；胰蛋白酶，美國Life公司；miR- 146a mimics及陰性對照mimics- NC，由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000，美國Invitrogen公司；RNA逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司；miR- 146a及內參U6引物，廣州市銳博生物科技有限公司設計合成；Transwell小室，美國Corning公司；基質膠，美國BD公司。

1.3.2 人肺鱗癌細胞篩選 采用qRT- PCR法。取人肺鱗癌細胞(SK- MES- 1、NCI- H520、NCI- H2170、NCI- H226)和正常肺組織上皮細胞(BEAS- 2B)，采用TRIzol法提取細胞總RNA，余步驟同1.2，篩選miR- 146a相對表達量最低的細胞系進行后續實驗。結果顯示，SK- MES- 1、NCI- H520、NCI- H2170、NCI- H226及BEAS- 2B細胞miR- 146a相對表達量分別為0.57±0.08、0.21±0.06、0.44±0.09、0.37±0.10、1.03±0.02。與BEAS- 2B細胞比較，SK- MES- 1、NCI- H520、NCI- H2170、NCI- H226細胞中miR- 146a相對表達量明顯降低(P均<0.01)。NCI- H520細胞miR- 146a相對表達量明顯低于SK- MES- 1、NCI- H2170、NCI- H226細胞(P均<0.01)。故選擇NCI- H520細胞進行后續實驗。

1.3.3 上調miR- 146a表達細胞模型建立及驗證 取NCI- H520細胞和BEAS- 2B細胞接種于含10% FBS的高糖DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，每2天更換1次培養液。當細胞鋪至培養瓶底80%～90%時，0.25%胰酶消化、傳代。取傳5代對數生長期NCI- H520細胞，接種于6孔板中，隨機分為miR- 146a mimics組、mimics- NC組和空白對照組，miR- 146a mimics組每孔加入100 pmol miR- 146a mimics及5 μL轉染試劑，mimics- NC組每孔加入100 pmol mimics- NC及5 μL轉染試劑，嚴格按LipofectamineTM2000試劑說明書進行轉染。空白對照組不進行任何處理。各組繼續培養24 h，采用qRT- PCR法檢測miR- 146a相對表達量，步驟同1.2。結果顯示，miR- 146a mimics組、mimics- NC組和空白對照組miR- 146a相對表達量分別為5.56±0.11、0.98±0.04、1.02±0.03，miR- 146a mimics組miR- 146a相對表達量明顯高于mimics- NC組和空白對照組(P均<0.01)。說明上調miR- 146a表達細胞模型制作成功，可用于后續實驗。

1.3.4 細胞遷移和侵襲能力檢測 采用Transwell小室法。實驗前用無血清的培養液饑餓處理轉染miR- 146a mimics、mimics- NC的NCI- H520細胞。①細胞遷移實驗：Transwell小室膜水化預處理，于Transwell小室上室每孔加入含2×105個細胞的細胞懸液，下室加入含10% FBS的培養基，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h，取出小室，棉簽擦凈上室內未遷移細胞，固定、染色，顯微鏡下觀察。隨機取5個200倍視野，計數穿膜細胞數，以此表示細胞遷移能力。實驗重復3次，取平均值。②細胞侵襲實驗：將Transwell小室進行包被基質膜處理，用基質膠包被Transwell小室基底膜，待基質膠凝固后進行后續實驗，其余步驟同細胞遷移實驗。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 肺鱗癌組織、癌旁正常組織、正常肺組織miR- 146a表達比較 肺鱗癌組織miR- 146a相對表達量為0.46±0.09，癌旁正常組織和正常肺組織分別為0.99±0.04、1.03±0.03。肺鱗癌組織miR- 146a相對表達量明顯低于癌旁正常組織和正常肺組織(P均<0.01)，而癌旁正常組織與正常肺組織比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 肺鱗癌組織miR- 146a表達與患者臨床病理參數的關系 見表1。

表1 肺鱗癌組織miR- 146a表達與患者 臨床病理參數的關系

2.3 轉染miR- 146a的肺鱗癌NCI- H520細胞遷移和侵襲能力變化 細胞遷移實驗中，轉染miR- 146a mimics、mimics- NC的NCI- H520細胞穿入Transwell小室下室的細胞數目分別為(30±8)、(81±10)個/HP，二者比較P<0.01。細胞侵襲實驗中，轉染miR- 146a mimics、mimics- NC的NCI- H520細胞穿入Transwell小室下室的細胞數目分別為(19±5)、(43±9)個/HP，二者比較P<0.05。

3 討論

miRNA是一類長度為17～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3′非編碼區結合，降解mRNA，在轉錄后水平調節靶基因表達。目前已證實，在人類復雜的基因調控網絡中miRNA具有極其重要的作用，在眾多疾病的發生、發展過程中發揮重要作用。隨著對miRNA研究的不斷深入，很多miRNA已被證實在惡性腫瘤的發生、發展過程中起癌基因或抑癌基因作用[14]。但到目前為止，關于miRNA在惡性腫瘤中的具體分子機制仍未完全明確。

miR- 146a基因定位于染色體5q33，其在自身免疫性疾病、炎癥反應、腫瘤等病理過程中發揮重要作用[15]。miR- 146a在不同腫瘤中作用不同，甚至相反。如miR- 146a在胃癌[16]、乳腺癌[17]、前列腺癌[18]及胰腺癌[19]等組織中表達下調，具有類似抑癌基因作用；在宮頸癌組織中表達上調，具有類似癌基因作用[20]。說明miR- 146a在不同腫瘤中存在組織或細胞特異性，miR- 146a在不同惡性腫瘤中可能通過調控不同的通路來參與腫瘤的發生、發展。但國內外有關肺鱗癌組織miR- 146a表達的研究相對較少。

本研究結果顯示，肺鱗癌組織中miR- 146a表達明顯低于癌旁正常組織及正常肺組織，說明miR- 146a在肺鱗癌中可能具有類似抑癌基因作用；肺鱗癌組織中miR- 146a表達變化與腫瘤組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移有關，說明miR- 146a表達變化與肺鱗癌的發生、發展有關，有可能作為判斷肺鱗癌進展的分子生物學標志物。進一步研究發現，人肺鱗癌細胞(SK- MES- 1、NCI- H520、NCI- H2170、NCI- H226)miR- 146a表達明顯低于正常肺組織上皮細胞(BEAS- 2B)，進一步證實miR- 146a低表達與肺鱗癌的發生有關。

侵襲和轉移是惡性腫瘤的基本生物學特征。臨床研究發現，約90%的惡性腫瘤患者死于腫瘤的侵襲和轉移[21]。說明腫瘤侵襲和轉移是影響惡性腫瘤患者預后的重要因素。研究證實，miR- 146a能夠影響惡性腫瘤細胞的侵襲和遷移[13,16,19]。本研究選擇miR- 146a表達最低的肺鱗癌NCI- H520細胞，通過脂質體轉染上調細胞中miR- 146a表達，并觀察上調miR- 146a表達對肺鱗癌NCI- H520細胞遷移和侵襲能力的影響。結果發現，上調miR- 146a表達的肺鱗癌NCI- H520細胞遷移和侵襲能力明顯降低，提示miR- 146a有可能成為肺鱗癌靶向治療的潛在靶點。目前有關miR- 146a調控肺鱗癌細胞侵襲和遷移的具體分子生物學機制尚不明確，在胰腺癌中miR- 146a通過抑制EGFR和NF- κB信號通路抑制腫瘤細胞侵襲[19，22]，在胃癌中miR- 146a通過靶向WASF2抑制胃癌細胞侵襲和遷移[16，23]。但miR- 146a在肺鱗癌中調控侵襲和轉移的具體機制鮮見報道，尚需進一步研究。

綜上所述，肺鱗癌組織miR- 146a表達下調，其表達變化與腫瘤的惡性生物學行為有關；miR- 146a能明顯抑制肺鱗癌細胞的侵襲和遷移能力，這為探討其發病機制及臨床診療提供了新思路。

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