L-谷氨酸氧化酶的研究進展

于 爽，遲乃玉，張慶芳*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

L-谷氨酸氧化酶的研究進展

于 爽1，2，遲乃玉1，2，張慶芳1，2*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

L-谷氨酸氧化酶是一種潛在的十分有用的工具酶，其輔酶是黃素腺嘌呤二核苷酸，是一種黃素蛋白酶類。以L-谷氨酸為底物，將其降解為過氧化氫、氨和α-酮戊二酸，具有高度底物特異性。該文從L-谷氨酸氧化酶的來源、應用、克隆表達與分離純化進行了闡述，并對其研究前景進行了展望。

L-谷氨酸氧化酶；來源；應用；克隆表達；純化；研究前景

L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase，GLOD）是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）為輔酶的L-氨基酸氧化酶，能在不添加外源性輔助因子的條件下氧化L-谷氨酸脫氨，生成α-酮戊二酸、氨和過氧化氫[1-2]。L-谷氨酸氧化酶對反應底物具有高特異性和高親和力，反應條件溫和，催化效率高，在食品、工業發酵及醫藥行業有廣泛的應用。該酶自20世紀80年代發現以來，一直是國內外的研究熱點，是潛在的工具酶之一。研究至今，國內外對L-谷氨酸氧化酶研究的熱點主要集中在兩方面，一是借助現階段觀察及測定方法研究酶的作用機制及結構，二是繼續開發高產酶活性菌株及研究如何利用酶特性服務于人生活及工業應用。

1 L-谷氨酸氧化酶的來源

L-氨基酸氧化酶來源豐富，在蛇毒液[3]、許多動物和微生物中均能分離到，微生物來源較為廣泛，但是其產酶能力均不高。現研究階段，L-谷氨酸氧化酶多是從微生物中分離得到，其中鏈霉菌類產酶能力相比較其他菌種較強，其酶產量達到6.4 U/mL。L-谷氨酸氧化酶的首次發現是JURTSHUK和MEMANUS在維涅蘭德固氮菌的膜制備物中發現的，但是其并不具有底物特異性[4]；真正意義上的首次證實是1983年KAMEI T等[5]在淺紫鏈霉菌（Streptomyces violascens）發酵液中證實了L-谷氨酸氧化酶的存在，其相對分子質量約為60 000，具有黃素蛋白特征的吸收光譜，不需要外源性輔助因子參與，但其專一性不強，對L-谷氨酸、L-谷氨酰胺及L-組氨酸均有作用。

20世紀90年代中國開始了對L-谷氨酸氧化酶的研究。1991年，徐水清等[6]在從土壤中分離出的放線菌中檢測到了L-谷氨酸氧化酶活性，并研究了其產酶的影響因素。1992年，李青山等[7]對產酶菌株進行了選育誘變研究并成功得到一株高產酶菌株，固體發酵將其酶活提高了近25倍。而后又采用液體發酵優化發酵條件，酶活達到1.84 U/mg，相比固態發酵酶活提升了1.72倍。

2013年，盧嬋等[8]將來自Streptomycessp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因與表達載體pET28a連接，導入大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達，L-谷氨酸氧化酶比酶活達到1.1 U/mg。隨后上3L發酵罐進行發酵，重組菌BL21（DE3）/pET28a-LGOX產L-谷氨酸氧化酶比酶活達到1.61 U/mg。近年來，國內外科學家分別從土壤中分離出了能產L-谷氨酸氧化酶的放線菌、鏈霉菌，完善了該酶發酵產酶體系，分離得到粗酶液，酶學性質研究表明，能高度專一分解L-谷氨酸生成氨、α-酮戊二酸和過氧化氫。

綜上所述，自然界中產L-谷氨酸氧化酶的菌株很多，主要篩選到的菌株是放線菌及鏈霉菌。研究顯示鏈霉菌產酶能力較好，更適合應用于工業生產。現階段的研究方向主要是對該酶基因進行克隆并進行表達，提高其產酶能力，為更加廣泛地應用提供基礎。

2 L-谷氨酸氧化酶的應用

2.1 在生物傳感器上的應用

L-谷氨酸在醫藥、食品添加劑、營養強化劑等領域具有十分廣泛的作用[9]，但是其人均日允許攝入量不超6 g/d，食用過量L-谷氨酸會出現十分明顯的中毒癥狀，表現在頭痛、眩暈及臉部大量出汗[10]等。因此對于食品及臨床樣品中L-谷氨酸含量的檢測是十分重要且必要的。L-谷氨酸常用的傳統檢測方法有電位滴定、華勃氏呼吸測定法和色譜分析[11]等，這些方法耗時耗力還需要高端精密設備[12]。因此考慮應用生物傳感器來檢測L-谷氨酸[13-14]，生物傳感器具有快速、靈敏度高、設備簡單等優點。

測定L-谷氨酸的生物傳感器常采用L-谷氨酸氧化酶、谷氨酸脫羧酶及谷氨酸脫氫酶作為酶膜[15]。L-谷氨酸氧化酶具有高度底物特異性，且不存在可逆反應等其他兩種酶不具有的優勢，因此廣泛應用于生物傳感器[16]，用于測定食品及臨床樣品中L-谷氨酸的含量及其偶聯反應。

1989年WOLLENBERGER U等[17]打開了L-谷氨酸氧化酶在生物傳感器上的應用開端，將L-谷氨酸氧化酶固定到過氧化氫電極上，該電極能穩定使用10 d以上并測定超過500個樣品中0～0.14 g/L范圍內的谷氨酸，測定時間僅為2 min。

1993年國內開始了對L-谷氨酸氧化酶生物傳感器的研究，楊慶玲等[18]制成擴散控制型電極，并且應用該電極制備了流動注射分析系統，其方法是將L-谷氨酸氧化酶酶膜與過氧化氫探頭復合。將L-谷氨酸準確測定范圍增大到1.0 g/L，響應時間縮短20 s。2013年，懷紅霞等[19]將L-谷氨酸氧化酶與納米金材料固定到一起，納米金材料具有表面自由能高、比表面積高等特性，極大地提高了測量精度，使其能準確測定0.2～2.0 g/L的谷氨酸含量。

谷氨酸生物傳感器最初的研究集中在酶電極的制作。盡管十幾年來人們不斷改進固定工藝及應用新的材料，但由于酶的穩定性差及提取困難等弱點，其應用受到了極大的限制。隨著微生物固定化技術的不斷進步，以微生物活體為探測元的微生物電極應運而生，是當今的研究熱點。

2.2 在測定轉氨酶活性上的應用

臨床醫學上檢驗肝功能的重要指標是肝臟細胞中谷草轉氨酶（aspartate transaminase，AST）與谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的含量，作用反應方程式[20]為：

檢測其含量與活性的常規方法是丙酮酸氧化酶法[21]和賴氏法[22]。L-谷氨酸氧化酶對L-谷氨酸具有高度底物特異性，而谷草轉氨酶（AST）與谷丙轉氨酶（ALT）與底物反應會產生L-谷氨酸，因此將兩個反應偶聯用于測定谷草轉氨酶（AST）與谷丙轉氨酶（ALT）的活性與含量。

李青山等[23-24]利用L-谷氨酸氧化酶粗制品研究創立了利用分光光度計測定谷草轉氨酶（AST）與谷丙轉氨酶（ALT）的方法。比色法測得谷草轉氨酶（AST）與谷丙轉氨酶（ALT）的活性，顯色反應為Trinder反應[25]，即H2O2與4-氨基安替吡啉偶聯苯酚在過氧化物酶的催化下生成紅色化合物。1995年，馮德榮等[26]研究并制作了測定轉氨酶的生物傳感器，將固定的L-谷氨酸氧化酶和過氧化氫電極結合，谷丙轉氨酶（ALT）酶活力在4～106 U/L、谷草轉氨酶（AST）酶活力在21～129 U/L范圍內該裝置具有較好的精確性。

2.3 在測定肌酐上的應用

血肌酐的含量是臨床用于檢測腎功能的參數之一。肌氨酸氧化酶法[27]和堿性苦味酸法[28]常用于測定肌酐的含量，測定反應方程式為：

1993年，RUI C S等[29]利用L-谷氨酸氧化酶創立了流動注射系統測定血肌酐的含量。其特色性的采用雙通路測定來避免血液中內源性谷氨酸和氨對測定的影響。第一響應為內源性氨谷氨酸和肌酸酐的總和響應；第二響應為內源性氨和谷氨酸的響應，其測量范圍分別達到為2 mmol/L和3 mmol/L。該系統具備良好的穩定性和重現性，與化學方法獲得的化驗結果中肌酐的含量呈良好的相關性。

3 L-谷氨酸氧化酶的克隆表達及酶分離純化研究

L-谷氨酸氧化酶的發酵生產受到很多因素的影響，其中最大的影響因素是至今為止所篩選到的菌株產酶能力不強，其次就是發酵條件及分離純化技術的影響。

3.1 L-谷氨酸氧化酶的克隆表達

L-谷氨酸氧化酶距工業化發酵生產還有很大的距離，很大程度上限制了其應用。因此需要進一步提高其產酶能力，充分發揮菌株的生產能力，顯著提高發酵產量。

L-谷氨酸氧化酶研究至今，國內外所見報道中L-谷氨酸氧化酶產酶能力均不強，極大的限制了其應用，因此采用基因工程的方法構建工程菌來提高產酶能力是十分重要且常見的手段。2001年，CHEN C Y等[30]對灰色鏈霉菌（Streptomyces platensis）NTU3304的L-谷氨酸氧化酶基因進行了克隆研究，他們將產酶基因克隆重組在變鉛青鏈霉菌中。研究結果顯示，該產酶基因全長2 130 bp，由710個密碼子組成，前體分子質量大小為78 ku，成熟后分子質量大小為76 ku，由三個亞基組成。

2013年，盧嬋等[31]將Streptomycessp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因克隆重組，并在原核表達載體大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達。研究結果顯示L-谷氨酸氧化酶比酶活達到1.1U/mg；而后又進行了3L發酵罐發酵產酶研究，結果顯示重組產酶菌產L-谷氨酸氧化酶比酶活達到1.61U/mg。

目前，美國Sigma公司已利用基因工程技術，以大腸桿菌為宿主菌構建了產酶工程菌，極大提高了產酶能力和穩定性，并將其應用于商業化生產，為其進一步研究應用創造了條件。

3.2 L-谷氨酸氧化酶的分離純化研究

最近幾十年，L-谷氨酸氧化酶因為其實用性收到了廣泛的關注，但至今商業化用酶國內仍沒有實現量產，主要依靠國外進口，價格昂貴，主要原因是酶的分離純化困難，極大限制了應用。目前，L-谷氨酸氧化酶的主要分離純化方法仍是一些常規柱層析方法，常見的包括離子交換層析、高壓液相層析、親和層析、凝膠過濾層析等。

KAMEI T等[32]最早開始了對L-谷氨酸氧化酶純化的研究，他們將粗酶液經硫酸銨沉淀透析后，經過L-谷氨酸氧化酶-瓊脂糖凝膠6B層析柱、L-谷氨酰胺-瓊脂糖凝膠6B層析柱、羥基磷灰石柱，葡萄糖G-100層析柱純化后獲得純化酶。純化后比酶活達到60.3 U/mg，純化倍數達914倍，回收率為27.5%。

SUKHACHEVA M V等[33]先將粗酶液經過硫酸銨沉淀，而后經過用DEAE纖維素柱和葡聚糖凝膠G-25凝膠過濾獲得純化酶，純化后酶液比酶活達到50.8 U/mg，純化倍數達907倍。徐水清[34]將0.041 4 U/mg的粗酶液經過硫酸銨沉淀，DEAE纖維素柱，葡聚糖凝膠G-25處理后，酶活達到4.11 U/mg，純化倍數為99倍。他們所使用的分離純化方法和SUKHACHEVA M V等[33]相同。沈群[35]采用的分離純化方法更為方便，但是其純化效果不是特別理想，其將L-谷氨酸氧化酶粗酶液經過硫酸銨沉淀后直接用聚丙烯酰胺葡聚糖S-200-HR分子篩過濾。結果顯示，粗酶液比酶活為0.009 5 U/mg，經純化后，獲得酶活為0.087 U/mg的酶液，純化倍數為9.2倍，回收率為2.7%。李玲等[36]利用華美鏈霉菌（Streptomycessplendeds）4.66發酵生產L-谷氨酸氧化酶，而后對酶進行了分離純化研究。其采用的方法更為完善，首先將粗酶液進行高速冷凍離心，后進行硫酸銨分級沉淀，而后用SephadxG-25進行脫鹽，然后進行MonoQ離子交換、SuperdexG-200凝膠層析及冷凍干燥等步驟得到純化的L-谷氨酸氧化酶。純化后的L-谷氨酸氧化酶比酶活為176U/mg，純化倍數為926倍，回收率為12.95%。盧嬋等[31]將粗酶液經過高速離心后進過硫酸銨沉淀，HisTrapTMFF親和層析后獲得單一的L-谷氨酸氧化酶蛋白條帶，純化后L-谷氨酸氧化酶比酶活為2.1 U/mg，蛋白純化倍數為1.9倍。

4 前景與展望

21世紀注定是生物技術產業蓬勃發展的時代，酶制劑作為生物技術產業的中流砥柱發展十分迅速。究其原因，其應用范圍十分廣泛，在食品、造紙、醫藥、臨床醫學、工業發酵等行業均有十分重要的作用。近幾十年許多工業生產工藝的革新，對酶制劑的需求提高導致我國酶制劑產業發展更為迅猛，每年酶制劑產量達上百萬噸，經濟產值巨大。

L-谷氨酸氧化酶作為一種較新的實用工具酶，目前國內仍未能實現酶制劑的工業化生產；另外其作用機制及蛋白質三維結構罕見報道。希望在不久的將來，隨著生物技術及分子生物技術的進步，研究者們能夠闡明其作用機理，構建出更適用于工業生產的工程菌，使其能夠得到更加廣泛的應用，造福于人類的生產與生活。

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Research progress on L-glutamate oxidase

YU Shuang1,2,CHI Naiyu1,2,ZHANG Qingfang1,2*
(1.School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China;2.Liaoning Technology of Marine Microbiological Engineering Research Center,Dalian 116622,China)

L-glutamate oxidase is a potentially useful tool enzyme,and it is a flavoprotein with FAD as coenzyme.Using L-glutamate as substrate,L-glutamate oxidase catalyzes L-glutamic acid into hydrogen peroxide,ammonia and α-ketoglutaric acid with high substrate specificity.In this overview,the L-glutamate oxidase sources,application,cloning and expression,isolation and purification were summarized,and the research prospects of the L-glutamate oxidase were proposed.

L-glutamate;source;application;cloning and expression;purification;research prospects

Q554

0254-5071（2017）10-0009-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.003

2017-03-04

遼寧省教育廳高等教育內涵發展專項資金項目；遼寧省教育廳生物工程培養模式改革專業項目（GM201418）

于 爽（1986-），女，實驗師，碩士，研究方向為微生物與酶工程。

*通訊作者：張慶芳（1965-），女，教授，博士，研究方向為微生物與酶工程。