產纖溶酶菌株L21的鑒定與發酵條件研究

嚴 翠，孫玉英，*，劉丹丹，柳 婷，劉斌彬，王淑軍

（1.淮海工學院 海洋學院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發研究院，江蘇 連云港 222005）

產纖溶酶菌株L21的鑒定與發酵條件研究

嚴 翠1，孫玉英1，2*，劉丹丹1，柳 婷1，劉斌彬1，王淑軍2

（1.淮海工學院 海洋學院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發研究院，江蘇 連云港 222005）

利用纖維蛋白平板法從海參體內腸道中篩選到一株產纖溶酶活力較高的菌株L21，通過16S rDNA序列測定比對分析，初步鑒定菌株L21為交替假單胞菌（Pseudoalteromonassp.）。采用單因素試驗、Plackett-Burman試驗及響應面法對菌株L21的發酵條件進行優化，結果表明，菌株L21最佳發酵工藝條件為NaCl 1 g/L，CaCl21.03 g/L，MgSO40.8 g/L，初始pH 7.40。在此工藝條件下，菌株L21纖溶酶活力達到399.86 U/mL，較優化前（86.09 U/mL）提高了4.64倍。體外溶血實驗結果表明該菌株具有作為安全性溶栓劑的潛力。

交替假單胞菌；纖溶酶；Plackett-Burman試驗；響應面法

血栓性疾病是嚴重威脅人類健康的心腦血管疾病，治療血栓性疾病最為有效、安全的手段主要是采用纖溶酶或纖溶酶原激活劑進行的溶栓療法[1]。通過溶解過剩的纖維蛋白，使血栓溶解，從而達到血液循環通暢的目的[2]。微生物在自然界中種類多、易培養、繁殖快，而且發酵工業相對完善發達，可短期內得到大量目的產物[3]，及其纖溶酶在口服給藥的血栓疾病中有一定的優勢。因此，微生物纖溶酶的研究在近幾十年中已經引起了廣大醫療工作者的興趣。但是長期以來也受以下兩個問題的制約：其一，發酵法產酶活力較低，有待于進一步提高；其二，多數已報道的微生物纖溶酶最佳條件和人類生理條件不一致，存在安全性問題，從而使得進一步研究受到限制。如對芽孢桿菌HQS-3粗酶液的體外溶血實驗[4]的研究可知，將其開發為溶栓藥物的風險會增加；從Alteromonas piscicida中提取的纖溶酶在人體血漿中孵育后[5]，酶活力完全受到了抑制，使其應用范圍受到限制。

有研究認為，海水的化學性質接近人的血漿，可以提供新的代謝產物，特別是酶，具有較低或沒有毒副作用，可以用于治療血栓[6]。海洋微生物經過漫長的環境適應，其作為產酶資源具有突出的特點和優勢。目前，海洋微生物中只有少數幾種纖溶酶已經被鑒定及純化，包括Alteromonas piscicida[5]、Bacillus subtilis[7-8]、Bacillus amyloliquefaciens[9]等。因此，海洋資源具有很大的開發潛力。

本實驗室從海參腸道中分離出一株纖溶酶活性較高的海洋菌株L21，其粗酶在體外不引起溶血反應，是一株很有潛力被開發為安全、有效的溶栓藥物的細菌。本研究采用單因素試驗對菌株L21產纖溶酶所需的碳源、氮源進行篩選，采用Plackett-Burman法挑選對產酶影響較大的因素，然后以纖溶酶酶活為響應值，采用響應面分析法對該菌株產纖溶酶的發酵條件進一步優化，以期提高該菌株的產酶能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

菌種L21：本實驗室從海參腸道中篩選得到的產纖溶酶活性較高的海洋菌株。

1.1.2 主要試劑

羧甲基纖維素鈉、酪蛋白、NaCl、CaCl2、FeCl3、MgSO4（均為化學純）、酪氨酸、瓊脂糖、瓊脂粉（均為生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：英國OXOID公司。

1.1.3 培養基

Luria-Bertani（LB）固體培養基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.0。

血瓊脂平板：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉20 g/L，雞血50～100 mL。

種子培養基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

初始發酵培養基：羧甲基纖維素鈉5 g/L，酵母提取物5 g/L，酪蛋白2 g/L，NaCl 2 g/L，CaCl20.5 g/L，FeCl30.8 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 7.0。

1.2 儀器與設備

SPX-250B-Z型生化培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；CR22G高速冷凍離心機：日本日立公司；5418小型臺式高速離心機：德國艾本德股份公司；T6系列紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海一恒科技有限公司；T100梯度PCR儀：美國伯樂公司；ZWY-211C恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；DYY-2C型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株L21的種子液制備及發酵

將菌株L21在LB固體培養基上活化后，從單菌落中挑取一環接種于裝液量為50 mL/250 mL種子培養基中，在30℃、160 r/min條件下搖床培養24 h后作為種子液。將4%的菌株L21種子液接種于初始發酵培養基中，于30℃發酵培養60 h。

1.3.2 纖溶酶酶活力的測定

參照VIJAYARAGHAVAN P等[10]的方法有所改進。將發酵液在4℃條件下6 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。于25 mL比色管中加2 mL 2.5%的纖維蛋白溶液，再加2 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl（含有0.01 mol/L的CaCl2，pH 7.8），然后加1 mL粗酶液，37 ℃孵育30 min后，加入5 mL 0.11mol/L的三氯乙酸（含有0.22mol/L的乙酸鈉和0.33mol/L的乙酸）終止反應，10000r/min離心20min，取上清液在波長280 nm處測定吸光度值。并用酪氨酸標準品繪制酪氨酸與吸光度值的標準曲線，線性回歸方程為：y=0.0004x+0.0235（相關系數R2=0.993 4）。根據標準回歸方程計算樣品中酪氨酸的含量。酶活力單位定義：在37℃條件下，每分鐘水解纖維蛋白生成1 μg酪氨酸所需的酶量為一個酶活力單位（U/mL）。

1.3.3 菌株鑒定及系統進化樹分析

16S rDNA序列擴增與測序：從菌株L21的單菌落中挑取一環于0.1 mL無菌ddH2O中并吹吸混勻后煮沸5 min，以此為模板進行聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）擴增。引物序列：27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR反應體系為50μL，反應條件：95℃預變性5min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸l min，共30個循環，然后72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，并用試劑盒純化產物。PCR產物送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，序列用BLAST程序與數據庫中核酸序列進行同源性搜索，采用ClustalX 1.81進行序列比對，通過MEGA 6.06軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹。

1.3.4 單因素試驗

通過單因素試驗，以10 g/L的添加量從羧甲基纖維素鈉、殼聚糖、蔗糖、幾丁質、麥芽糖、果糖、葡萄糖和淀粉中篩選出最優碳源，以10 g/L的添加量從酪蛋白、牛肉膏、硝酸鈉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、魚粉和豆粕粉中篩選出最優氮源。

1.3.5 Plackett-Burman試驗設計[11]

本實驗采用Plackett-Burman（PB）試驗設計，對羧甲基纖維素鈉（X1）、酪蛋白（X2）、酵母粉（X3）、NaCl（X4）、CaCl2（X5）、FeCl3（X6）、MgSO4（X7）、接種量（X8）、溫度（X9）、裝液量（X10）、初始pH（X11）和發酵時間（X12）這12個因素進行考察，從而選出對纖溶酶酶活力影響顯著的因子。

1.3.6 響應面分析[12]

根據PB試驗的結果，選取對酶活力具有顯著性影響的因素，以NaCl（A）、CaCl2（B）、MgSO4（C）和初始pH（D）為影響因素，纖溶酶活力（Y）為響應值，進行響應面優化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 菌株L21發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization of strain L21

1.3.7 體外溶血實驗

參照HUANG S等[13]的方法有所修改。將50 μL粗酶液置于打孔的血瓊脂平板上，于37℃孵育3 d，觀察是否有透明圈。以枯草芽孢桿菌ATCC6633的粗酶液作為參考。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定及系統進化樹分析

圖1 基于菌株L21 16S rDNA序列的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain L21 based on 16S rDNA sequence

經PCR擴增并對其產物進行序列測定，得到一段長度為1 498 bp的序列（GenBank accession：KM229514），對其進行同源性序列比對，并下載與該菌株同源性較高的具有代表性的菌株序列，利用ClustalX1.81軟件進行序列匹配比對，通過MEGA 6.06軟件構建系統發育樹，結果見圖1。由圖1可知，菌株L21與交替假單胞菌聚成一群，菌株的序列相似性達到98%以上，綜合其顯微形態特征，可初步確定該菌株為交替假單胞菌（Pseudoalteromonassp.）的一個株系，把菌株命名為Pseudoalteromonassp.L21。

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同碳源對酶活力的影響

考察不同碳源對菌種L21纖溶酶酶活力的影響，結果見表2。

由表2可知，以羧甲基纖維素鈉作為碳源時，菌株L21產纖溶酶酶活力最高，為98.56 U/mL，殼聚糖和蔗糖次之，其余碳源產纖溶酶酶活力均低于初始發酵產酶活力（86.09 U/mL），因此，選羧甲基纖維素鈉為最優碳源。

表2 不同碳源對纖溶酶酶活的影響Table 2 Effect of different carbon sources on the fibrinolytic enzyme activity

2.2.2 不同氮源對酶活力的影響

表3 不同氮源對纖溶酶酶活的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on the fibrinolytic enzyme activity

由表3可知，以酪蛋白為氮源時，產纖溶酶酶活力最高，且高于初始纖溶酶酶活力（86.09 U/mL），其余氮源產纖溶酶酶活力均低于初始發酵產酶活力，因此選酪蛋白為最優氮源。

2.3 PB試驗設計及結果

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件，選用N=19進行PB試驗設計，每個因素取高水平（+1）和低水平（-1）兩個水平。以纖溶酶酶活為響應值，每組試驗設置3個平行，試驗因素和水平見表4，試驗結果與分析見表5，主效應分析結果見表6。

由表6中的P值可知，NaCl、CaCl2、MgSO4和初始pH對纖溶酶酶活影響最大，因此選擇NaCl、CaCl2、MgSO4和初始pH為自變量進行響應面試驗。

表4 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 4 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

表5 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 5 Design and results of Plackett-Burman experiments

表6 Plackett-Burman試驗各因素主效應分析Table 6 Main effects analysis of each factor of Plackett-Burman experiments

2.4 響應面分析試驗結果

根據PB試驗結果，利用中心組合試驗設計（central composite design，CCD）對這4個影響顯著的因素NaCl（A）、CaCl2（B）、MgSO4（C）和初始pH（D）進一步優化，其中NaCl的添加量和pH值對纖溶酶酶活力的影響為正效應，MgSO4和CaCl2的添加量對纖溶酶酶活力的影響為負效應，因此，為了提高纖溶酶酶活力，需要增加NaCl的添加量，提高pH值，并降低MgSO4和CaCl2的添加量。中心組合試驗設計與結果見表7。

表7 中心組合試驗設計與結果Table 7 Design and results of central composite experiments

續表

運用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表7中的數據進行回歸分析，方差分析結果見表8。對各因素進行二次多元回歸擬合后，得到回歸方程：

表8 響應面試驗結果方差分析Table 8 Variance analysis of response surface experiments results

決定系數R2=0.937 7，修正相關系數R2Adj=0.879 6，表明方程的擬合度很好，可以代替真實試驗點結果進行分析。由表8可知，該回歸模型的P＜0.000 1，該模型的影響極顯著，失擬項不顯著（P=0.214 7＞0.05），表明模型擬合度高，一次項A、B、C、D和交互項AB、CD對響應值的影響極顯著（P＜0.01），交互項BC對響應值顯著影響（P＜0.05），說明該模型可以用于該菌株產纖溶酶發酵優化的理論預測[14]。

各因素交互作用的響應面分析結果見圖2。

圖2 NaCl、CaCl2、MgSO4和初始pH的交互作用對纖溶酶活力影響的響應面與等高線Fig.2 Response surface and contour line of the effects of interaction between NaCl,CaCl2,MgSO4and initial pH on fibrinolytic enzyme activity

由圖2可知，3個響應面中只有一個是開口向下的凸形曲線，說明存在極大值，但最優條件并不都在于所設計的因素水平范圍內。在回歸方程中二次項系數A2、C2、D2系數為正數，B2的系數為負數，表明響應面極值點可能不止一個，不能直接從該響應面上找出最佳工藝。因此需要使用Design-Expert軟件對工藝條件進行優化，在模型取值范圍內選擇最低點為起始點，進行快速上升法優化[15]。

經響應面分析得出菌株L21產纖溶酶最佳發酵條件為：NaCl1g/L，CaCl21.03g/L，MgSO40.8g/L，初始pH7.40，在此條件下進行3次驗證試驗，纖溶酶酶活力達到399.86U/mL，與預測值（408.82 U/mL）相符，較優化前纖溶酶活力（86.09 U/mL）提高了4.64倍。

2.5 體外溶血試驗

圖3 菌株L21體外溶血試驗結果Fig.3 Results ofin vitrohemolysis experiments of strain L21

由圖3可知，目的菌株L21（左）的粗酶液在血瓊脂平板上沒有形成透明圈，但對照（右）卻在平板上形成了透明圈，說明目的菌株L21通過發酵培養并沒有產生導致紅細胞破裂溶解而引起溶血現象的物質，菌株L21在體外無溶血作用，可作為一種比較安全的溶栓劑，有開發為注射劑或藥物制劑的潛力。

3 結論

本實驗從海參腸道內篩選出一株產纖溶活力較強的菌株L21，通過16S rDNA序列分析，初步鑒定菌株L21為交替假單胞菌（Pseudoalteromonassp.），并采用響應面分析法對菌株L21產酶發酵條件進行優化。結果表明，菌株L21產酶的最佳條件分別為NaCl 1 g/L，CaCl21.03 g/L，MgSO40.8 g/L，初始pH 7.40。在此條件下，菌株L21發酵產纖溶酶酶活為399.86 U/mL，較優化前纖溶酶活力（86.09 U/mL）提高了4.64倍。因此用響應面法優化菌株L21產纖溶酶發酵條件是有效可行的。體外溶血試驗結果表明，菌株L21在體外不引起溶血反應，說明它是一個潛在的安全性較高的溶栓劑。此外，本課題組還研究了該菌株的部分酶學性質，發現該菌株粗酶液的最適pH值為7.5，最適作用溫度為35℃，接近人體溫度，說明它能在人體內發揮很好的療效，對其開發為溶栓藥物有重要的價值，也對拓展海洋溶栓藥物的來源是一個有益的探索。

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Identification of fibrinolytic enzyme-producing strain L21 and its fermentation conditions

YAN Cui1,SUN Yuying1,2*,LIU Dandan1,LIU Ting1,LIU Binbin1,WANG Shujun2
(1.College of Marine Science,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China;2.Marine Resources Development Institute of Jiangsu,Lianyungang,222005,China)

A high activity fibrinolytic enzyme-producing strain L21 was isolated from the intestinal tract of sea cucumbers by fibrinogen plate method.Strain L21 was identified asPseudoalteromonassp.by 16S rDNA sequence determination and analysis.The single factor experiments,Plackett-Burman experiments and response surface methodology were applied to optimize the fermentation conditions of strain L21.The results showed that the optimum fermentation process conditions of strain L21 were NaCl 1 g/L,CaCl21.03 g/L,MgSO40.8 g/L and initial pH 7.40.Under the conditions,the fibrinolytic enzyme activity of strain L21 was up to 399.86 U/ml,which was 4.64 times higher than that of before optimization(86.09 U/mL).The results ofin vitrohemolysis experiments indicated that strain L21 had potential as a safe-soluble suppository.

Pseudoalteromonassp.;fibrinolytic enzyme;Plackett-Burman experiments;response surface methodology

Q815

0254-5071（2017）10-0076-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.017

2017-06-15

國家自然科學基金資助項目（41306165）；碳谷-江蘇海資院海洋先進材料聯合研究中心（TG-201402）；江蘇省海洋生物技術重點實驗室開放課題（2009HS001）

嚴 翠（1993-），女，碩士研究生，研究方向為海洋微生物及其活性物質。

*通訊作者：孫玉英（1974-），女，副教授，博士，研究方向為海洋微生物酶技術。