紅肉蘋果分裂素響應基因MdMYB308的克隆與表達分析

王意程，王楠，許海峰，張宗營，姜生輝，張靜，曲常志，陳學森

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紅肉蘋果分裂素響應基因的克隆與表達分析

王意程，王楠，許海峰，張宗營，姜生輝，張靜，曲常志，陳學森

（山東農業大學園藝學科與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安271018）

細胞分裂素是調控植物花青苷合成的重要激素，從新疆紅肉蘋果雜種一代優系‘紫紅3號’中克隆得到分裂素響應基因，研究其在細胞分裂素調控蘋果花青苷合成中的作用，為進一步完善紅肉蘋果育種的理論與技術體系提供參考。以紅肉蘋果‘紫紅3號’（新疆紅肉蘋果與‘富士’雜交1代）的紅色幼嫩葉片為外植體誘導的紅色愈傷組織為試材，設計引物利用PCR克隆，對其進行生物信息學分析；并用不同濃度細胞分裂素處理，采用熒光定量PCR分析及花青苷合成相關基因的表達；通過酵母雙雜交試驗、熒光雙分子互補試驗驗證MdMYB308與MdbHLH3的互作關系。在‘紫紅3號’中克隆獲得全長，其包含768 bp完整的開放閱讀框，編碼255個氨基酸，預測其編碼蛋白質分子量為28.37 kD，等電點為8.94；系統進化樹分析表明，與、、在同一個進化枝上，氨基酸序列比對發現，MdMYB308蛋白存在EAR抑制序列；提高6-BA濃度有利于蘋果愈傷組織花青苷的累積，與無細胞分裂素處理相比，1 mg·L-16-BA處理愈傷花青苷合成結構基因、、與轉錄基因、的表達量升高，而表達被抑制；酵母雙雜交與熒光雙分子互補試驗表明，MdMYB308與MdbHLH3能相互作用。細胞分裂素（6-BA）可能通過抑制的表達影響MdMYB308與MdbHLH3的結合從而促進花青苷的累積。

蘋果；分裂素；；酵母雙雜；雙分子熒光互補

0 引言

【研究意義】新疆紅肉蘋果（f.(Dieck) Langenf）是新疆野蘋果的變型，其富含花青苷等次生代謝產物，具有花、果、葉、枝均為紅色的特點，是現代蘋果品質育種的重要種質；但其高花青苷性狀缺乏挖掘與利用，成為制約單一傳統栽培品種向特色多樣化發展的重要因素[1]。因此，以新疆紅肉蘋果與栽培蘋果品種的雜交分離群體為試材，積極探討響應外源分裂素調控花青苷合成代謝機制，完善蘋果紅色性狀遺傳與發育機理，對傳統品種的性狀改良及豐富栽培蘋果遺傳基因庫具有重要意義[2-3]?！厩叭搜芯窟M展】花青苷生物合成是植物類黃酮合成途徑的重要分支。利用模式植物同源克隆技術已從大多數植物中分離鑒定了花青苷合成酶及相關轉運蛋白基因[4-7]。然而，除了植物本身的種性（遺傳性）外，花青苷的合成同時受到外界環境（光、溫度、激素等）的調控[8-12]。細胞分裂素作為調控花青苷合成的重要激素之一，已在擬南芥、甘藍、蘿卜等植物中篩選與驗證[13-15]。研究發現，6-BA可以誘導結構基因、和的表達，促進擬南芥葉片花青苷的累積，且過表達分裂素合成基因的植株比野生型花青苷含量高[15]。在轉錄水平上，外源細胞分裂素有利于MYB類轉錄基因的表達從而間接促進植物花青苷的積累[16]。此外，AtMYBL2轉錄因子是具有EAR結構的MYB類抑制子，研究表明細胞分裂素可以抑制的表達而增強擬南芥中花青苷的代謝合成[17]?！颈狙芯壳腥朦c】筆者課題組于2006年率先建立了以新疆野蘋果及其紅肉變性為親本的雜種分離群體[18]。針對雜交一代中果實質地、類黃酮含量、香氣等性狀遺傳變異特點，對其不同株系間品質性狀比較及相關基因表達分析，并深入探討激素與氮對花青苷生物合成的影響[19-22]，但外源分裂素調控蘋果花青苷代謝機理及相關MYB轉錄因子的研究，尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】采用不同濃度6-BA處理紅肉愈傷組織，并進行花青苷相關基因的熒光定量分析，通過酵母雙雜交與雙分子熒光互補（BIFC）試驗研究MdMYB308與MdbHLH3的關系，探討外源分裂素對蘋果花青苷MYB轉錄因子的調控機制，為研究紅肉蘋果花青苷代謝分子機理與高品質蘋果品種選育提供參考。

1 材料與方法

試驗于2016年在山東農業大學園藝科學與工程學院進行。

1.1 試驗材料及處理

以新疆紅肉蘋果與富士雜交F1代分離群體中選出的‘紫紅3號’優株幼嫩葉片誘導的紅色愈傷組織為試材，將正常培養（0.3 mg?L-1NAA+0.6 mg?L-16-BA）的愈傷組織轉接到NAA濃度為0.3 mg?L-1、6-BA濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mg?L-1的MS培養基（Solarbio）上。每天進行16 h的光照培養，光強為2 000—2 500 lx，溫度設置為（24±2）℃。處理20 d后取樣，液氮速凍，-80℃保存。

1.2 植物總RNA的提取與qRT-PCR

總RNA的提取方法參照TianGen RNA Plant Reagent 操作說明。反轉錄利用Fermentas公司生產的ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA。熒光定量使用伯樂 CFX96實時定量PCR儀，總反應體系20 μL，包括10 μL 2.5×RealMasterMix/ 20×SYBR Solution，1 μL cDNA模板（50 ng·μL-1），上下游引物各1 μL （5 μmol·L-1），7 μL ddH2O。運行程序為：①95.0℃預變性 30 s；②95.0℃變性5 s；③58℃退火10 s；④72.0℃延伸30 s（②—④共45個循環）；⑤65℃孵育 20 s；⑥溶解溫度從55℃到95℃每升高0.5℃保持1 s；⑦停止反應。每個樣品設置3個重復。以蘋果肌動蛋白作為內參，數據的分析采用2-ΔΔCT方法。

1.3 蘋果MdMYB308的克隆、生物信息學分析

在蘋果基因組中根據擬南芥中AtMYBL2蛋白序列進行Blast比對得到了一個基因序列號為MDP0000249611的基因，分別設計上下游引物F：5′-ATGGGAAGGTCTCCTTGC-3′，R：5′-TCATTTCA TCTCCAAGCTTCT-3′。具體反應體系：cDNA 2 μL，上下游引物各2.5 μL，5×HFbuffer 10 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，酶0.5 μL，ddH2O 31.5 μL。PCR程序為：98℃30 s；98℃10 s，56℃30 s，72℃ 45 s，30個循環；72℃10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳并回收目的條帶，連接PLB零背景載體（VT205）進行測序。

MdMYB308蛋白通過Expasy網站（http://web. expasy.org/protparam/）進行理化性質分析，NCBI軟件Blast比對蛋白質氨基酸序列，MEGA5.0軟件構建系統進化樹。

1.4 花青苷含量的測定

稱取愈傷組織0.25 g，液氮研磨至粉末加入10 mL 1%HCL甲醇，4℃浸提24 h，12 500 r/min離心25 min，吸取上清液進行測定。以鹽酸甲醇為空白，利用分光光度計測定樣品提取液在530 nm下的吸光值，每g樣品的吸光值為花青苷含量（Abs·g-1FW）。

1.5 酵母雙雜試驗

用引物5′-CCATATGATGGGAAGGTCTCCTTGC -3′和5′-CGGATCCTCATTTCATCTCCAAGCTTCT-3′擴增MdMYB308的編碼框序列，用引物5′-GGAATTC ATGGCTGCACCGCC-3′和5′-GGATCCTTAAGAGTC AGATTGGGGTATAATTT-3′擴增MdbHLH3的編碼框序列，將膠回收產物連接PLB零背景載體。酶切連接構建pGBKT7-MdbHLH3和pGADT7- MdMYB308重組載體。將重組載體質粒同時轉化到酵母Y2H感受態細胞，分別培養在二缺-Leu/Trp與四缺-Ade/-His/ -Leu/-Trp選擇性培養基中，并在四缺培養基中添加X-α-gal進行檢測。

1.6 雙分子熒光互補試驗

用引物5′-CGGGATCCATGGGAAGGTCTCCTT GC-3′和5′-GCGTCGACTTTCATCTCCAAGCTTCTG TA-3′擴增MdMYB308的編碼框序列，用引物5′-GGA TCCATGGCTGCACCGCC-3′和5′-GGGGTACCAGA GTCAGATTGGGGTATAATTTG-3′擴增MdbHLH3的編碼框序列，之后連接PLB零背景載體。用H I和I對MdMYB308-PLB和pSPYNE分別進行雙酶切，用H I和I對MdbHLH3-PLB和pSPYCE分別進行雙酶切，構建NYFP-MdbHLH3和CYFP-MdMY308重組載體。將這兩個重組載體分別轉化農桿菌LBA4404感受態細胞，振蕩培養至OD600約為0.8，洋蔥內表皮浸入農桿菌菌液30 min，轉入附加乙酰丁香酮（100 μmol·L-1）的MS固體培養基中，28℃暗培養1—2 d。在激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，Zeiss 510 Meta）下觀察、掃描。

2 結果

2.1 蘋果MdMYB308的克隆與生物信息學分析

如圖1所示，以‘紫紅3號’誘導愈傷組織cDNA為模板，克隆得到一條大小約800 bp的條帶。對克隆片段回收測序發現，該基因的開放閱讀框長度為768 bp，編碼255個氨基酸，蛋白質分子量為28.37 kD，理論等電點為8.94。

圖1 MdMYB308編碼區全長的RT-PCR擴增

如圖2所示，對來自不同物種的MYB家族基因構建系統進化樹。其中，蘋果與、、在同一進化枝上，因此推測蘋果中與、、功能相似。利用NCBI蛋白結構分析發現，MdMYB308具有EAR抑制序列（圖3）。

2.2 愈傷組織花青苷積累對細胞分裂素濃度的響應試驗

從圖4、5可以看出，隨著培養基6-BA濃度的升高，愈傷組織中的顏色逐漸變深，花青苷含量也呈上升趨勢，6-BA濃度到達1 mg?L-1時，花青苷含量最高。

如圖6所示，愈傷組織在含1mg?L-16-BA的培養基培養20d后，與無分裂素培養基（對照）相比，花青苷合成相關基因表達量都有不同程度的上升，其中表達量約為對照的3—4倍，轉錄基因、的表達量是對照的4倍左右，而表達明顯被抑制。

圖2 花青苷合成相關MYB轉錄因子進化樹分析

圖3 花青苷合成MYB轉錄因子氨基酸序列比對

圖4 不同分裂素濃度下的蘋果愈傷組織

圖5 不同分裂素濃度對蘋果愈傷組織花青苷含量的影響

CHS：查爾酮合成酶；CHI：查爾酮異構酶；DFR：二氫黃酮醇還原酶；UFGT：尿苷二磷酸葡萄糖﹕類黃酮-3-O-糖基轉移酶；LDOX：花白素雙加氧酶；F3H：黃烷酮-3-羥化酶；MYB10：MYB家族轉錄因子；bHLH3：bHLH家族轉錄因子；MYB308：MYB家族轉錄因子

2.3 MdMYB308 與 MdbHLH3 酵母雙雜試驗

由圖7酵母雙雜交試驗可得，空載體pGADT7和MdbHLH3+pGBKT7、空載體pGBKT7和MdMYB308 +pGADT7共轉Y2H均在二缺板上生長，在四缺及四缺+X-α-gal不生長；而MdbHLH3和MdMYB308共轉Y2H在二缺、四缺及四缺+X-α-gal都能生長，因此推測其在酵母體內能夠相互作用。

2.4 MdMYB308與MdbHLH3 雙分子熒光互補試驗

將MdMYB308-NYFP和MdbHLH3-CYFP共同轉入洋蔥表皮細胞，如圖8所示，通過激光共焦顯微鏡掃描得到洋蔥表皮核內產生黃色YFP熒光信號。此外，單獨用空載CYFP與MdMYB308-NYFP共同轉入洋蔥表皮細胞中沒有檢測到YFP信號，因此推測其在植物體內能夠相互作用。

3 討論

外源激素作為環境因素之一，對植物花青苷代謝合成具有重要作用[20-22]。其中，細胞分裂素促進植物花青苷合成的研究已有諸多報道[23-24]。前人研究發現，6-BA濃度在10-9—10-6μmol?L-1有利于蘿卜細胞中花青苷的累積，但超過10-6μmol?L-1將抑制花青苷的合成[13]。在擬南芥中，細胞分裂素可以激活花青苷結構基因、、、以及轉錄因子的表達[15-16]。本研究發現，提高6-BA濃度促進紅肉蘋果愈傷組織的花青苷合成；花青苷結構基因、、與相關轉錄因子、都有不同程度上升，而顯著下降，說明細胞分裂素促進紅肉蘋果愈傷組織花青苷的合成與結構基因以及MYB類轉錄因子的差異表達有關。

SD/-T-L：缺少色氨酸、亮氨酸選擇性培養基；SD/-Trp-Leu-His-Ade：缺少色氨酸、亮氨酸、組氨酸、腺嘌呤選擇性培養基；SD/-Trp-Leu- His-Ade（X-α-gal）：缺少色氨酸、亮氨酸、組氨酸、腺嘌呤選擇性培養基并添加X-α- gal作為底物檢測β-galactosidase

CYFP：pSPYCE載體-CYFP熒光；NYFP：pSPYNE載體-NYFP熒光

目前，EAR元件是廣泛存在于植物轉錄因子中的一段保守抑制序列，在植物防御及非生物脅迫中具有重要作用[25-27]。MYB蛋白家族是植物中成員最多的轉錄因子家族之一。在擬南芥中，AtMYB4蛋白首先被報道其C端存在EAR序列并通過直接綁定下游結構基因啟動子發揮抑制作用[28-29]。在高等植物花青苷合成代謝途徑中，R2R3-MYB家族蛋白中的FaMYB1存在EAR元件，異源表達FaMYB1抑制煙草中花青苷的合成[30-31]。DUBOS等[17]發現，AtMYBL2作為一種存在EAR元件的新型抑制子與EGL3、GL3、bHLH轉錄蛋白結合調控花青苷的合成，而細胞分裂素可以降低的表達。本研究發現，MdMYB308蛋白C端存在EAR元件并與MdbHLH3蛋白互作，說明MdMYB308可能與MdbHLH3結合抑制蘋果花青苷的合成。

針對果樹特色種質或新品種與傳統栽培品種在品質性狀形成與調控機理方面的差異特點，借鑒模式植物的最新研究進展與成果，結合現代分子生物技術與果樹配套栽培方法，完善理論體系解決生產難題，是近年來果樹研究領域理論聯系實踐的重要趨勢。激素調控植物花青苷代謝合成已成為近年來的研究熱點。本研究結果為蘋果生產栽培技術提供理論支持，并為進一步選育具有高花青苷的蘋果品種奠定了基礎。

4 結論

在‘紫紅3號’葉片誘導的蘋果愈傷中，克隆了，進化樹分析證明MdMYB308與AtMYB4、FaMYB1、AtMYBL2在同一進化枝上，氨基酸序列比對發現MdMYB308存在EAR抑制序列；的表達受細胞分裂素6-BA的抑制；MdMYB308可以與MdbHLH3結合。結果表明MdMYB308可能作為抑制子參與細胞分裂素調控花青苷的合成。

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（責任編輯 趙伶俐）

Molecular Cloning and Expression Analysis of Cytokinins Responsive Gene

WANG Yicheng, WANG Nan, XU Haifeng, ZHANG Zongying, JIANG Shenghui, ZHANG Jing, QU Changzhi, CHEN Xuesen

(College of Horticultural Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong)

Cytokinin is an important hormone in the regulation of anthocyanin synthesis in plants. To develop the theory and technology for red flesh apple breeding, the function in the cytokinin regulating anthocyanin metabolism of MYB transcription factor genef.F1population was studied.The callus induced from the leaves of ‘Zihong No.3’ apple was used as materials. Theand anthocyanin biosynthesis related genes in callus which grown on different concentrations of 6-BA was studied by the qRT-PCR. Meanwhile, the interaction between MdbHLH3 and MdMYB308 was verified by yeast two-hybrid system and bimolecular fluorescence complementation assay.The full length of,,andare located in the same evolutionary branch. The aligned protein sequences revealed that MdMYB308 contain the EAR motif. Furthermore, the content of anthocyanin rose as 6-BA concentration increased as well. The transcript levels of anthocyanin structural genes (,,) and transcription factors (,) were significantly higher in callus grown on 1 mg?L-16-BA compared with 6-BA-deprived callus. In contrast, the expression ofwas inhibited. The results of yeast two hybrid experiments and bimolecular fluorescence complementation assays showed that the MdMYB308 could interact with MdbHLH3.Cytokinin (6-BA) could promote anthocyanin accumulation by down-regulating the expression ofwhich may destroy the combination of MdMYB308 and MdbHLH3.

apple; cytokinin;; yeast two hybrid experiments; bimolecular fluorescence complementation assays

2017-05-07；接受日期：2017-08-24

國家重點研發計劃（2016YFC0501505）、國家自然科學基金（31730080）

王意程，Tel：18206381380；E-mail：2270841499@qq.com。通信作者陳學森，Tel：0538-8249338；E-mail：chenxs@sdau.edu.cn