雞原代肝細胞培養及葉酸對脂質代謝相關基因表達的影響

劉艷利，黨燕娜，段玉蘭，楊小軍

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雞原代肝細胞培養及葉酸對脂質代謝相關基因表達的影響

劉艷利，黨燕娜，段玉蘭，楊小軍

（西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100）

腹脂沉積是目前家禽養殖過程中的一個普遍現象。與哺乳動物不同，家禽的脂質代謝主要發生在肝臟，前人很多研究發現葉酸和IGF2均參與調控動物的脂質代謝，因此，試驗旨在建立雞原代肝細胞培養條件，并研究葉酸對雞原代肝細胞脂質代謝相關基因表達的影響，為體外探究葉酸調控家禽脂質代謝機制提供依據。采用膠原酶消化配合雞淋巴細胞分離液純化法分離得到雞原代肝細胞，用高碘酸希夫氏染色方法進行肝細胞鑒定；同時分離得到的肝細胞用正常培養基培養36 h后，更換含不同葉酸濃度的培養基（0，1，5，10，15，和20 mg·L-1），每個葉酸濃度6個重復，處理12 h后收集上清液，并收集細胞提取總RNA，用RT-qPCR法檢測基因相對表達量，MTT法檢測細胞增殖，商業試劑盒方法檢測上清液中LDH含量。并分析基因表達之間的相關性以及葉酸劑量與基因表達之間的回歸關系。采用膠原酶消化配合雞淋巴細胞分離液純化法可以獲得分離效果好且純度高的雞肝細胞；不同劑量的葉酸沒有影響肝細胞培養液中的LDH活性（＞0.05），也沒有對肝細胞的增殖產生影響（＞0.05）；與1 mg·L-1劑量的葉酸對照組相比，10、15和20 mg·L-1的葉酸顯著降低了肝細胞IGF2以及與脂質合成代謝有關的ACC和FAS基因的表達（＜0.05），但葉酸并沒有對雞肝細胞中與脂質分解代謝有關的CPT1和PPARα基因的表達產生影響（＞0.05）；并且雞肝細胞中ACC和FAS基因的表達與IGF2存在一定的正相關（＜0.05）；除此之外，雞肝細胞IGF2，FAS和ACC的表達與葉酸劑量也存在著線性和二次曲線的回歸關系（＜0.05）。葉酸的添加可降低雞原代肝細胞中與脂肪酸合成相關基因的表達，并且FAS和ACC基因的表達可能與IGF2具有正相關關系；本試驗中葉酸的最適劑量為15 mg·L-1。

葉酸；IGF2；肝細胞；脂質代謝；雞

0 引言

【研究意義】在目前的家禽養殖過程中，畜牧工作者長期偏重生產性能選育的同時也出現了體脂沉積過度等問題，其不僅影響家禽的肉、蛋產量和品質，由其引發的腹水癥等代謝疾病也會給養禽業帶來巨大的經濟損失。與哺乳動物不同，雞體內90%—95%的脂肪合成主要發生在肝臟器官[1]，故而，體外研究家禽的脂質代謝應該首選原代肝細胞模型。家禽的脂質沉積除了受遺傳和環境等因素的影響外，營養水平也對其起重要作用，近些年來，關于通過營養素途徑來調控家禽脂質代謝的報道越來越多[2-4]，因此，體外建立雞原代肝細胞培養體系，對探究營養素調控家禽脂質代謝的分子機制具有重要意義。【前人研究進展】有研究表明，日糧葉酸的添加可以降低豬血清中膽固醇[5]和甘油三脂[6]的含量；母鼠飼喂含5 mg·kg-1葉酸的日糧可顯著降低小鼠血清甘油三脂濃度[7]。日糧單獨添加1.5 mg·kg-1葉酸或者混合添加煙酸60 mg·kg-1與葉酸1.5 mg·kg-1均顯著降低了肉雞的腹脂率[8]；喻小瓊的研究指出種雞日糧高的葉酸添加量能降低后代出殼時脂肪酸合成基因的表達[3]。除此之外，有研究報道給妊娠期和哺乳期的小鼠飼喂高脂日糧能夠提高子代肝臟IGF2、PPARα和CPT1的表達，指出IGF2可能參與調控脂質代謝[9]。【本研究切入點】家禽腹脂率高的問題會給養殖業帶來一定的損失，SPENCER等[10]研究表明雞被植入人重組IGF2后能顯著提高腹脂率；并且IGF2基因也被研究表明與雞脂肪性狀有關，可作為候選基因去選育低腹脂雞品系[11]，因此IGF2基因在家禽中與脂質代謝有關。家禽養殖中本研究團隊前期研究指出葉酸能改變雞脾臟和胸腺IGF2的表達[12]。但葉酸和IGF2在家禽的脂質代謝中究竟如何發揮調控作用？它們之間又存在怎樣的內在聯系？很少有關于這方面的報道。【擬解決的關鍵問題】葉酸作為營養素在機體內的代謝較為復雜，無法直接進行機制探究，故本試驗通過建立體外培養雞原代肝細胞模型，探究葉酸對雞原代肝細胞脂質代謝相關基因表達的影響，為體外探究葉酸調控家禽脂質代謝機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1日齡剛出殼的健康公雞，購自陜西楊凌巨隆禽業有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

葉酸、MTT和膠原酶IV購自Sigma公司；Trizol、RNA反轉錄試劑盒和SYBR試劑盒購自TaKaRa公司；RPMI 1640正常培養基、無葉酸培養基以及青鏈霉素（雙抗）購自Gibco公司；胎牛血清購自南美BIOWEST公司；乳酸脫氫酶（LDH）和高碘酸希夫氏染色（PAS）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，雞淋巴細胞分離液和DMSO購自索萊寶公司。

核酸定量分析儀（Nanodrop ND-1000）；實時熒光定量PCR儀（iQ5），購自Bio-Rad 公司；多功能酶標儀（基因有限公司）；細胞培養六孔板（美國康寧公司）；離心機（Eppendorf）；CO2培養箱；搖床；倒置顯微鏡。

1.3 肝細胞分離

試驗雞處死后置于75%酒精中消毒15 min后轉至無菌超凈臺，打開腹腔取出肝臟浸到含有5×雙抗的PBS中進行清洗；隨后用眼科剪子將肝臟剪成小碎塊，并用PBS低速離心清洗4遍；將干凈的組織碎塊轉至PBS配制的消化液中（含0.5 g·L-1的膠原酶IV和0.6 g·L-1的CaCl2）37℃恒溫搖床消化50 min；細胞懸液分別經100目和200目細胞篩過濾后，先50×g低速離心去除部分非實質性肝細胞，然后用含1×雙抗的PBS 120 ×g離心清洗細胞3遍；將細胞制成懸液之后輕輕加至雞淋巴細胞分離液之上，250×g離心20min去除血細胞和非實質性肝細胞，抽取分離液與細胞懸液界面的霧狀肝細胞懸液并用PBS清洗2遍，用培養基重懸細胞，計算細胞濃度后，按106·mL-1細胞密度接種到六孔板中，進行試驗，按5×105·mL-1接種到培養皿進行后續染色形態學觀察。消化體系中鈣離子濃度、膠原酶類型及濃度確定參考陳黎龍和劉騰飛的方法[13-14]，低速離心及淋巴細胞分離液去除血細胞和非實質性肝細胞參考江青艷和Puviani的試驗方法[15-16]。

1.4 肝細胞培養及試驗處理

細胞在12 h過夜貼壁后換液，培養36 h后細胞長勢穩定并出現融合交匯基本鋪滿板壁80%左右時，開始換處理培養基，處理培養基分別含0、1（正常對照培養基）、5、10、15和20 mg·L-1葉酸，每個葉酸濃度下6個重復。在處理12 h后，收集上清液，用PBS清洗細胞2遍后加Trizol，裂解5 min后用移液槍吹打收集裂解液，轉至﹣80℃保存。

1.5 RT-PCR檢測基因 mRNA相對表達水平

細胞RNA的提取以及RNA反轉錄合成cDNA的過程均參照試劑盒說明書進行。熒光定量試驗使用TaKaRa 公司的SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒，選用β-actin作內參基因。基因引物序列見表1。RT-PCR的反應程序為：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸 30 s，40個循環。采用2-△△Ct法計算基因相對表達量[17]。

1.6 細胞上清液LDH活性與細胞PAS染色

細胞上清液中乳酸脫氫酶的酶活及細胞PAS染色進行形態學觀察的步驟均參照試劑盒說明書進行操作。

表1 基因引物序列

1.7 MTT法檢測細胞增殖

細胞的培養處理方法同1.4，參照前人研究方法[18]，在96孔板上每個葉酸濃度設置10個重復，在處理結束前4 h，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1），輕輕拍打培養板四周使其均勻，處理結束后，去除培養液，每孔加入180 μL DMSO，搖床搖10 min，用酶標儀檢測各孔的吸光度。

1.8 數據統計分析

數據分析利用SPSS 20.0統計軟件，采用One-way ANOVA進行單因素方差分析，并用Duncan法進行多重比較，顯著性判斷標準均設置為＜0.05。

2 結果

2.1 肝細胞染色及形態學觀察

如圖1所示，細胞培養24 h時，肝細胞呈典型上皮細胞樣的多角形，外周有鋸齒狀偽足向外伸展，呈集落狀生長；48 h時，肝細胞集落之間相互接觸出現連接匯合，呈現島嶼狀生長狀態；72 h時，島嶼狀間連接融合成片，細胞排列緊密；96 h時，細胞生長狀態仍維持良好，并且基本鋪滿整個培養皿底。PAS染色是一種糖原染色方法，能將肝細胞胞質中的肝糖原顆粒染成紅色，從對分離的雞原代肝細胞PAS染色可以看出，所分離的肝細胞純度較高，可用于后續試驗。

2.2 葉酸對肝細胞上清液中LDH活性的影響

葉酸對細胞上清液中LDH活性的影響見圖2，由圖可知，各個處理組LDH活性無顯著差異（＞0.05），LDH是由胞漿釋放到培養液中的，表明本試驗中的葉酸劑量并沒有對肝細胞產生損傷。

2.3 葉酸對肝細胞增殖的影響

葉酸對雞肝細胞增殖的影響見圖3，本試驗中不同劑量的葉酸對雞原代肝細胞的增殖并沒有產生影響（＞0.05）。

2.4 葉酸對肝細胞脂質代謝相關基因表達的影響

葉酸對肝細胞脂質代謝相關基因表達的影響如表2所示，與正常培養基對照組（含葉酸1 mg·L-1）相比，10、15和20 mg·L-1的葉酸顯著降低了雞肝細胞IGF2的表達（＜0.05），但0和5 mg·L-1的葉酸并沒有對IGF2基因的表達產生影響（＞0.05）。不同劑量葉酸對脂質分解代謝相關的肉堿酯酰轉移酶1（CPT-1）和過氧化物酶體增殖物活化受體α（PPARα）基因的表達沒有影響（＞0.05）；但與對照組相比，10、15和20 mg·L-1的葉酸顯著降低了脂肪酸合成酶（FAS）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的表達（＜0.05）；同樣，0和5 mg·L-1的葉酸并沒有對FAS和ACC的mRNA表達產生影響（＞0.05）。

圖1 不同培養時間的肝細胞PAS染色及形態

圖2 葉酸對肝細胞培養液中LDH活性的影響

圖3 葉酸對雞肝細胞增殖的影響

表2 葉酸對肝細胞脂質代謝相關基因表達的影響

2.5 FAS和ACC基因表達與IGF2表達的相關性分析

不同劑量葉酸處理下雞原代肝細胞IGF2表達與脂質合成代謝相關的FAS和ACC基因表達的相關性分析見圖4，FAS和ACC的表達與肝細胞IGF2的表達呈一定的正相關（＜0.05），值分別為0.685和0.808。

2.6 葉酸與脂質代謝相關基因表達的回歸分析

由表3可知，肝細胞基因的表達與葉酸的處理劑量存在著線性和二次曲線回歸關系（＜0.05），再結合表2中的基因表達分析，可以得出，在本試驗中葉酸的最佳處理劑量為15 mg·L-1。

圖4 雞肝細胞FAS和ACC表達與IGF2表達的相關性分析

表3 葉酸劑量與基因表達的回歸分析

3 討論

肝細胞的分離主要包括經典的原位灌注法[19]和酶消化法[20]，而前者需要專門的灌注設備，試驗所用酶量大、消費較高，也易污染[4]，故本試驗選擇酶消化法進行肝細胞的分離，并且為保證肝細胞不受動物采食日糧的影響，選擇1日齡剛出殼小雞作為試驗動物。肝細胞主要有肝實質細胞、非肝實質細胞和細胞內間隙組成[21]，本試驗結合前人的差速離心[22]和密度梯度離心方法[21]，用雞淋巴細胞分離液純化肝細胞。PAS肝糖原染色結果顯示細胞形態與前人描述的肝細胞形態一致[14, 16]，染色后細胞呈紅色反應，證明分離得到的是肝實質細胞，與蔣志惠的結果一致[23]。

LDH是存在于活細胞內的胞內酶，當細胞受到損傷后，才會通過細胞膜被釋放到細胞培養液中，因此，細胞培養液中的LDH活性在一定程度上反應了細胞的損傷情況[24]。劉騰飛等[14]通過檢測培養液中LDH活性指出分離的原代肝細胞在培養24 h后就可以適應體外的新環境并對在原代分離過程中損傷的細胞進行自我修復，因此本試驗選擇在細胞離體分離培養36 h，細胞融合并鋪滿80%左右開始添加處理。并且在處理結束后，各組培養液中的LDH活性并無顯著差異，說明本試驗中所添加的葉酸劑量并沒有對肝細胞產生損傷，并且MTT細胞增殖試驗也驗證了這一結果。

有研究指出IGF2過表達的轉基因小鼠其脂肪量顯著降低[25]，通過基因敲除使IGF2低表達的成年鼠往往也伴隨脂肪沉積的增加和肥胖的發生[26]，這些結果都顯示IGF2在哺乳動物中可能與脂肪的沉積是呈負相關的。但是，在家禽上的研究卻與此相反，人重組IGF2植入在雞體內后顯著增加了腹脂的沉積[10]，這種矛盾可能與不同動物機體脂質代謝的差異有關，畢竟家禽的脂質代謝多集中在肝臟而哺乳動物多是在脂肪組織。

本試驗的結果顯示葉酸的添加可降低肝細胞IGF2的表達，WANG等[27]的文中也提到IGF2與雞的脂質合成有關。雞肝細胞中與脂質代謝相關的基因表達結果也表明葉酸雖沒有影響脂質分解代謝相關基因的表達，但10、15、和20 mg·L-1的葉酸顯著降低了ACC和FAS的表達，此結果與喻小瓊[28]的研究類似，其試驗表明種雞日糧添加5 mg·kg-1的葉酸能顯著降低仔雞1日齡肝臟FAS的表達和仔雞16胚齡肝臟ACC的表達。并且葉酸的添加也能顯著降低雞脂肪細胞中FAS的表達[29]。ACC和FAS均是所參與反應的限速酶，控制脂肪酸的從頭合成，對肝細胞中FAS和ACC基因表達與IGF2進行相關性分析結果顯示它們之前具有正相關關系，因此印證了WANG等[27]的觀點，表明在家禽的脂質代謝中，IGF2可能與脂肪酸的合成具有正相關關系，但IGF2與FAS和ACC之間的具體聯系途徑，以及葉酸參與調控這些基因表達的機制，還有待進一步研究。

4 結論

葉酸的添加可降低雞原代肝細胞中與脂肪酸合成相關基因的表達，并且FAS和ACC基因的表達可能與IGF2具有正相關關系；本試驗中葉酸的最適劑量為15 mg·L-1。

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（責任編輯 林鑒非）

Effect of Folic Acid on Lipid Metabolism Associated Gene Expression in Primarily Cultured Chickens Hepatocytes

LIU Yanli, DANG Yanna, DUAN Yulan, YANG Xiaojun

(College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi)

Abdominal fat deposition is a universal phenomenon at present in poultry industry. Different from mammals, 90%-95% of lipid metabolism in poultry occurs in the liver. Previous studies have demonstrated folic acid and IGF2 were involved in animals lipid metabolism. The study was conducted to establish the method for primary culture of chicken hepatocytes and investigate the effects of folic acid on IGF2 and genes expression associated with lipid metabolism in primary chicken hepatocytes, further providing a basis for exploring lipid metabolism of poultry.Chicken hepatocytes were isolated by collagenase digestion combined with purification of chicken lymphocyte separation fluid, and evaluated by PAS staining,respectively. After 36 h culture of hepatocytes, cells were treated with different concentration of folic acid for 12 h. Hepatocytes proliferation and injury was detected by MTT method and LDH activity in culture medium respectively. Cells were collected to get total RNA for gene expression analysis by RT-PCR. Later, correlation analysis was carried out between IGF2 and lipid metabolism related genes expression. Regression analysis was performed between folic acid concentration and genes expression.The results showed that hepatocytes were isolated with high purity. Folic acid didn’t affect cell proliferation and cellular LDH activity (＞0.05).When compared with the control group (1 mg·L-1folic acid), 10, 15 and 20 mg·L-1folic acid significantly reduced IGF2 expression in chicken hepatocytes (＜0.05), and same phenomenon was observed in FAS and ACC expression. However, folic acid had no effects on CPT-1 and PPARα expression(＞0.05) . In addition, FAS and ACC expression had positive correlation with IGF2 mRNA level in chicken hepatocytes (＜0.05). There existed linear and quadratic regression between genes expression and folic acid concentration (＜0.05).In conclusion, folic acid could reduce gene expression associated with fatty acid synthesis in chicken hepatocytes. In addition, FAS and ACC mRNA level might have positive connection with IGF2 expression. Optimum treatment dose of folic acid was 15 mg·L-1in this study.

folic acid; IGF2; hepatocytes; lipid metabolism; chicken

2016-09-01；接受日期：2017-09-14

國家重點研發計劃（20170502200，2017YFD0500500）、陜西省科技統籌創新工程計劃項目（2017TSCXL-NY-04-04，2015KTCQ02-19）

劉艷利，Tel：18700807384；E-mail：1085752204@qq.com。通信作者楊小軍，E-mail：yangxj@ nwsuaf.edu.cn