飼料中添加谷氨酰胺前體物對鏡鯉腸道消化酶及Na+/K+-ATPase活性的影響

趙志剛，宋芳杰，2，王連生，羅 亮，王常安，李晉南，都 雪，徐奇友

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱 150070；2.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇無錫 214182)

飼料中添加谷氨酰胺前體物對鏡鯉腸道消化酶及Na+/K+-ATPase活性的影響

趙志剛1，宋芳杰1，2，王連生1，羅 亮1，王常安1，李晉南1，都 雪1，徐奇友1

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱 150070；2.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇無錫 214182)

為了研究谷氨酰胺前體物對鏡鯉(Cyprinuscarpiospecularis)腸道消化酶及Na+/K+-ATPase活性的影響，分別用谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、α-酮戊二酸(AKG)、L-鳥氨酸-α-酮戊二酸(OKG)、L-精氨酸-α-酮戊二酸(AAKG)、α-酮戊二酸鈉(2Na-AKG)替代基礎飼料中的葡萄糖(添加量為1.5%)，配制成6種等氮等能試驗飼料，以基礎飼料為對照，分別投喂松浦鏡鯉(平均體重(40.27±3.96)g)，飼養8周后測定鏡鯉腸道消化酶及Na+/K+-ATPase活性。結果顯示：Glu組前腸蛋白酶活性顯著高于對照組；Gln組、Glu組、OKG組和AAKG組中腸蛋白酶活性均顯著高于對照組。2Na-AKG組前腸脂肪酶活性顯著高于對照組和OKG組；2Na-AKG組中腸脂肪酶活性顯著高于對照組和Gln組。2Na-AKG組前腸淀粉酶活性均顯著高于對照組和Gln組。Gln組和Glu組前腸Na+/K+-ATPase活性均顯著高于對照組；不同處理組中腸Na+/K+-ATPase活性均顯著低于對照組；Glu組、AKG組和OKG組后腸Na+/K+-ATPase活性均顯著高于對照組，Gln組、AAKG組和2Na-AKG組后腸Na+/K+-ATPase活性則均顯著低于對照組。研究表明，飼料中添加Gln、Glu、OKG和AAKG可顯著提高魚體腸道的蛋白酶活性，添加2Na-AKG可顯著提高魚體腸道的淀粉酶和脂肪酶活性。

谷氨酰胺；前體物；鏡鯉(Cyprinuscarpiospecularis)；消化酶；Na+/K+-ATPase

谷氨酰胺(glutamine，Gln)是動物機體內含量最豐富的游離氨基酸，在機體內參與多種代謝物質的合成，可為機體中快速分裂的細胞提供能量，也是體內蛋白質和氨基酸的重要來源[1-3]。通常動物機體內 Gln 可以內源合成或通過外源添加獲得，但當機體處于病理或應激狀態時，內源Gln的合成量遠不能滿足機體的正常需求，從而導致機體內 Gln 相對缺乏[4]。研究表明，飼料中添加外源性Gln 能夠改善魚體腸道結構和功能，促進腸道發育[5-6]。然而，外源性 Gln 極不穩定，受熱后容易分解生成有毒物質[7]。鑒于此，不同學者對其相關替代物進行了深入研究[8-9]。從代謝角度看，Gln 的前體物，如谷氨酸(Glu) 、 α-酮戊二酸(AKG) 、L-精氨酸-α-酮戊二酸(AAKG) 、α-酮戊二酸鈉(2Na-AKG)、L-鳥氨酸-α-酮戊二酸 (OKG) 等都可能在動物機體中與Gln發揮相同或相似的功能。李晉南等[10-11]對鯉魚的研究表明，飼料中添加AKG、OKG、Glu可顯著影響魚體腸道的消化酶活性及腸道發育。魏玉強等[12]研究表明，飼料中添加 AKG 能夠促進鯉魚對飼料中蛋白質的同化利用。

松浦鏡鯉(Cyprinuscarpiospecularis)作為成功選育出的一個經濟新品種，由于其較好的體型優勢和經濟性狀，在全國范圍內已被廣泛養殖[13]。本試驗選擇了幾種 Gln 的代表性前體物Glu、AKG、OKG、AAKG和 2Na-AKG，研究Gln及其前體物對松浦鏡鯉腸道消化酶及Na+/K+-ATPase活性的影響，旨在為鯉飼料的科學配制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及飼料配制

試驗用魚來自中國水產科學研究院黑龍江水產研究所。選擇3 000尾規格整齊、體質健壯的松浦鏡鯉，在循環水養殖系統中暫養并馴化1周。暫養期間每日于07：30、12：30、16：30飽食飼喂基礎飼料；每天換水20 %，維持水溫在(25.0±2.0) ℃，溶氧濃度高于5.0 mg/L。

以魚粉和豆粕作為蛋白源，魚油、豆油和磷脂作為脂肪源，根據NRC(2011)及《鯉魚配合飼料》(SC/T1026-2002)要求配制基礎飼料。分別用谷氨酰胺、谷氨酸(Glu)、α-酮戊二酸、L-鳥氨酸-α-酮戊二酸、L-精氨酸-α-酮戊二酸、α-酮戊二酸鈉替代基礎飼料中的葡萄糖(添加量為1.5 %)，配制成6種等氮等能實驗飼料。表1列出了飼料的基礎組成及營養水平。將飼料原料粉碎并稱重，逐級混合均勻后，制成顆粒飼料(粒徑為2 mm)，在常溫條件下風干，4 ℃冰箱保存備用。OKG(AKG與L-鳥氨酸質量比為1∶1)、2Na-AKG、L-Glu、AAKG(AKG與L-精氨酸質量比為1∶2)和L-Gln均購自上海鼓臣生物技術有限公司，AKG購自Sigma公司，純度均大于或等于98.0 %。

1.2 試驗方法及管理

馴化結束后，挑取平均體重(40.27±3.96)g的松浦鏡鯉1 050尾，隨機將其分成7組，每組設5個重復，每個重復30尾魚。6個試驗組均隨機飼喂1種試驗飼料，對照組飼喂基礎飼料。試驗魚在室內循環水系統內養殖，養殖缸高0.6 m、直徑1.2 m，每天于07：30、12：30、16：30飽食投喂3次。養殖期間，系統內每天換水20 %，水溫保持在(25.0±2.0) ℃，溶解氧不低于5.0 mg/L。養殖期為8周。

1.3 樣品采集及指標測定

養殖試驗結束后將試驗魚饑餓24 h，之后進行采樣。每缸隨機取出2尾試驗魚用丁香油麻醉后，置于冰盤上解剖，分別取前中后腸道，用預冷的0.86%生理鹽水清洗腸道并用濾紙吸干，保存于盛有波恩氏液的5 mL離心管中，4 ℃保存待測。準確稱取試驗魚樣品，與預冷的0.86%生理鹽水按1∶9的比例(質量體積比)稀釋，勻漿，按不同檢測指標所需條件及試劑盒要求的速度和時間進行離心，離心后取組織上清液樣品-20 ℃保存待測。

表1 干物質基礎飼料組成及營養水平Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet in dry materiel %

注：1)維生素預混料為每千克飼料提供：VE 60 mg，VA 8 000 IU，VB615 mg，VC 500 mg，VB120.5 mg，VB230 mg，VD33 000 IU,VK35 mg，氯化膽堿5 000 mg，泛酸 50 mg，煙酸175 mg，葉酸 5 mg，肌醇 1 000 mg，D-生物素 2.5 mg。

2)礦物質預混料為每千克飼料提供：Se 0.4 mg，Zn 25 mg，Co 0.1 mg，Cu 3 mg，I 0.6 mg，Fe 25 mg，Mn 15 mg。

3) 粗脂肪和粗蛋白質均為實測值，其余為計算值。

蛋白酶(U/g prot)活性測定采用福林-酚(Folin-phenol)法。

脂肪酶(U/g prot)、淀粉酶(U/g prot)和Na+/K+-ATP酶(μmol Pi/(mg prot·hour))活性測定嚴格按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行。

1.4 統計分析

數據采用平均值±標準誤(mean ± S.E.)表示，通過SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，對差異顯著的數據采用Duncan氏法進行多重比較檢驗，差異顯著性的標志為P<0.05。

2 結果

2.1 谷氨酰胺前體物對鏡鯉蛋白酶活性的影響

不同谷氨酰胺前體物對松浦鏡鯉腸道蛋白酶活性的影響見表2。與對照組相比，Glu組魚體前腸蛋白酶活性顯著較高，而前腸蛋白酶活性在其它各組之間差異均不顯著。Gln組、Glu組、OKG組和AAKG組魚體中腸蛋白酶活性均顯著高于對照組。各處理組魚體后腸蛋白酶活性與對照組相比差異均不顯著，而AKG組和OKG組后腸蛋白酶活性均顯著高于AAKG組和2Na-AKG組。

2.2 谷氨酰胺前體物對鏡鯉脂肪酶活性的影響

谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉腸道脂肪酶活性的影響見表3。2Na-AKG組魚體前腸脂肪酶活性顯著高于對照組、AKG組和OKG組；2Na-AKG組魚體中腸脂肪酶活性顯著高于對照組和Gln組，其他各組間差異不顯著。與對照組相比，Glu組、AKG組、AAKG組和2Na-AKG組魚體后腸脂肪酶活性均顯著較低。

2.3 谷氨酰胺前體物對鏡鯉淀粉酶活性的影響

谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉腸道淀粉酶活性的影響見表4。2Na-AKG組魚體前腸淀粉酶活性顯著高于對照組和Gln組，其他各組間差異均不顯著。與對照組相比，其它各處理組魚體中腸和后腸的淀粉酶活性差異均不顯著，Gln組和AAKG組中腸淀粉酶活性顯著高于AKG組。

2.4 谷氨酰胺前體物對鏡鯉Na+/K+-ATPase活性的影響

與對照組相比，Gln組和Glu組魚體前腸Na+/K+-ATPase活性均顯著較高，其他各組與對照組相比差異均不顯著(表5)。不同處理組魚體中腸Na+/K+-ATPase活性均顯著低于對照組。在后腸中，Glu組、AKG組和OKG組魚體Na+/K+-ATPase活性均顯著高于對照組，而Gln組、AAKG組和2Na-AKG組Na+/K+-ATPase活性則均顯著低于對照組。

表2 不同谷氨酰胺前體物對松浦鏡鯉腸道蛋白酶的影響 (n=10)Tab.2 Effects of different precursors of Gln on intestinal protease of songpu mirror carp，C.carpio specularis (U/g prot)

注：同列無字母或數據肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

表3 不同谷氨酰胺前體物對松浦鏡鯉腸道脂肪酶的影響 (n=10)Tab.3 Effects of different precursors of Gln on intestinal lipase of songpu mirror carp，C.carpio specularis (U/g prot)

表4 不同谷氨酰胺前體物對松浦鏡鯉腸道淀粉酶的影響 (n=10)Tab.4 Effects of different precursors of Gln on intestinal amylase of songpu mirror carp，C.carpio specularis (U/g prot)

表5 不同谷氨酰胺前體物對松浦鏡鯉腸道Na+/K+-ATPase的影響 (n=10)Tab.5 Effects of different precursors of Gln on intestinal Na+/K+-ATPase of songpu mirror carp，Cyprinus carpio specularis (μmol Pi/mg prot·h)

3 討論

腸道是魚類特別是鯉魚等無胃魚營養物質消化吸收的主要場所。腸道生長發育以及其中的消化酶活性均與機體生長發育和營養物質的吸收息息相關。魚類腸道中蛋白質和脂肪的主要消化酶是胰腺分泌的蛋白酶和脂肪酶，兩種酶均以酶原形式進入腸道，再由腸道中的膽鹽等相應物質激活，因此腸道中蛋白酶和脂肪酶活力也能反映出胰腺消化酶分泌能力[14-15]。研究結果表明，魚體前腸和中腸蛋白酶活性遠高于后腸，說明松浦鏡鯉對蛋白質的主要消化區域在前中腸；而魚體中后腸脂肪酶和淀粉酶活性遠高于前腸，說明魚體對脂肪和淀粉主要消化區域集中在中后腸。

黃曉亮等[16]研究表明，肉雞飼料中外源添加Gln可顯著提高小腸蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。吳高齊等[17]在飼料中添加Gln顯著提高了野豬仔豬胰腺脂肪酶活性。Lin等[5]在飼料中添加Gln可顯著提高幼建鯉前、中、后腸道蛋白酶和脂肪酶活性。隨著研究的不斷深入以及對谷氨酰胺特性的了解，本實驗室對谷氨酰胺替代物及前體物進行了進一步的研究。李晉南等[11]研究表明，飼料中添加Gln、Glu和OKG均能一定程度地提高松浦鏡鯉腸道蛋白酶和脂肪酶活性，而OKG顯著提高了淀粉酶的活性。位瑩瑩[18]在松浦鏡鯉飼料中添加AKG顯著提高了腸道消化酶活性。陳迪等[19]在雜交鱘飼料中添加AKG可顯著提高其腸道蛋白酶活性。魏玉強[20]在不同蛋白源飼料中添加1.5%AKG顯著提高了松浦鏡鯉前腸和中腸蛋白酶和脂肪酶活性。本研究中結果表明，不同添加劑對大規格松浦鏡鯉魚種腸道消化酶活性均有一定程度的影響，其中Gln、Glu、OKG和AAKG可顯著提高魚體腸道蛋白酶活性，對飼料蛋白質消化能力的提高提供保障，2Na-AKG可顯著提高魚體腸道淀粉酶和脂肪酶活性，更有利于魚體對飼料淀粉和脂肪的消化。

魚類腸道管腔內表面有很多褶皺以及腸絨毛，可以增大食物與腸道的接觸面積和腸液的分泌面積，其與食物的消化吸收密切相關。腸道內Na+和K+的轉運是逆濃度梯度進行的，轉運過程需要能量的支持，而Na+/K+-ATPase可分解ATP為其提供能量，一些營養物質的吸收與Na+和K+的吸收通過Na+/K+-ATPase相偶聯，如氨基酸、葡萄糖等。研究表明，Na+/K+-ATPase活性是腸黏膜生長發育的重要標志[21-22]。Lin等[5]研究表明，飼料中添加1.2%的Gln對建鯉腸道Na+/K+-ATPase活力有顯著影響。徐奇友等[23]在飼料中添加0.5% Gln，哲羅魚腸道Na+/K+-ATPase活力提高了71%。本研究結果顯示，不同添加劑對松浦鏡鯉腸道Na+/K+-ATPase活性的影響均不相同，添加Gln和Glu可顯著提高魚體前腸Na+/K+-ATPase活性，而添加AKG和OKG則可顯著提高魚體后腸Na+/K+-ATPase活性。

綜上所述，飼料中添加Gln、Glu、OKG和AAKG可顯著提高松浦鏡鯉腸道蛋白酶活性，對飼料蛋白質消化能力的提高提供保障，2Na-AKG可顯著提高魚體腸道淀粉酶和脂肪酶活性，更有利于魚體對飼料淀粉和脂肪的消化。

[1]Wu G，Knabe D A，Flynn N E.Synthesis of citrulline from glutamine in pig enterocytes [J].The Biochemical Journal，1994，299(Pt 1)：115-121.

[2]Krebs H A，Baverel G，Lund P.Effect of bicarbonate on glutamine metabolism [J].The International Journal of Biochemistry，1980，12(1/2)：69-73.

[3]Newsholme E A，Carrie A L.Quantitative aspects of glucose and glutamine metabolism by intestinal cells [J].Gut，1994，35(1 Suppl.)：S13-S17.

[4]白由元，于明琨，劉震洋.谷氨酰胺與腸道免疫調節作用[J].中國臨床康復，2006，10(4)：153-155.

[5]Lin Y，Zhou X Q.Dietary glutamine supplementation improves structure and function of intestine of juvenile Jian carp (Cyprinuscarpiovar.Jian) [J].Aquaculture，2006，256(1/2/3/4)：389-394.

[6]Chen J，Zhou X Q，Feng L，et al.Effects of glutamine on hydrogen peroxide-induced oxidative damage in intestinal epithelial cells of Jian carp (Cyprinuscarpiovar.Jian) [J].Aquaculture，2009，288(3/4)：285-289.

[7]徐奇友，王常安，許 紅.外源性谷氨酰胺對虹鱒稚魚生長和腸道形態的影響[J].中國糧油學報，2009，24(4)：98-102.

[8]Brito Gerly A C，Carneiro-filho Benedito，oria Reinaldo B，et al.Clostridium difficile toxin A induces intestinal epithelial cell apoptosis and damage:role of Gln and Ala-Gln in toxin A effects [J].Digestive Diseases and Sciences，2005，50(7)：1271-1278.

[9]Kim S J，Koo O J，Kwon D K，et al.Replacement of glutamine with the dipeptide derivative alanyL-Glutamine enhances in vitro maturation of porcine oocytes and development of embryos [J].Zygote，2013，22 (2)：186-289.

[10]李晉南，徐奇友，位瑩瑩，等.谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉生長性能、體成分和血清生化指標的影響[J].東北農業大學學報，2013，44(12)：1-4.

[11]李晉南，徐奇友，王常安，等.谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉腸道消化酶活性及腸道形態的影響[J].動物營養學報，2014，26(5)：1347-1352.

[12]魏玉強，徐奇友，位瑩瑩，等.不同蛋白源飼料中添加α-酮戊二酸對松浦鏡鯉肌肉成分、血清氨基酸和生化指標的影響[J].東北農業大學學報，2015，46(1)：94-100.

[13]石連玉，李池陶，葛彥龍，等.黑龍江水產研究所鯉育種概要[J].水產學雜志，2016，29(3)：1-8.

[14]Zhou X Q，Zhao C R，Lin Y.Compare the effect of diet supplementation with uncoated or coated lysine on juvenile Jian carp (CyprinuscarpioVar.Jian) [J].Aquaculture Nutrition，2007，13：457-461.

[15]Vans D H，Claiborne J B.The Physiology of Fishes [M].BocaRaton，FL：CRC，Taylor & Francis，2006：305-366.

[16]黃曉亮，劉艷芬，廖建財，等.谷氨酰胺對肉雞腸道發育及小腸消化酶活性的影響[J].中國飼料，2009，14：38-41.

[17]吳高奇，李華磊，毛同輝，等.谷氨酰胺對特種野豬仔豬消化道發育及胰腺消化酶活性的影響[J].飼料添加劑，2015，36(12)：12-14.

[18]位瑩瑩.α-酮戊二酸對松浦鏡鯉生長性能、血清生化和腸道發育的影響[D].上海：上海海洋大學，2014.

[19]陳 迪，王連生，徐奇友.α-酮戊二酸對雜交鱘腸道形態、消化酶活力和抗氧化能力的影響[J].大連海洋大學學報，2014，30(4)：363-368.

[20]魏玉強.α-酮戊二酸對松浦鏡鯉氮代謝、抗氧化能力和小腸粘膜形態與功能的影響[D].上海：上海海洋大學，2015.

[21]Villanueva J，Vanacore R，Goicoechea O，et al.Intestinal alkaline phosphatase of the fishCyprinuscarpio:regional distribution and membrane association [J].Journal of Experimental Zoology，1997，279：347-355.

[22]Veillette P A，Young G.Temporal changes in intestinal Na+,K+-ATPase activity and in vitro responsiveness to cortisolin juvenile chinook salmon[J].Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2004，138(3)：297-303.

[23]徐奇友，王常安，許 紅，等.飼料中添加谷氨酰胺二肽對哲羅魚仔魚腸道抗氧化活性消化吸收能力的影響[J].中國水產科學，2010，17：351-356.

TheeffectsofadditionsofGlnanditsprecursorsondigestiveenzymeandNa+/K+-ATPaseactivitiesofintestineinCyprinuscarpiospecularis

ZHAO Zhi-gang1，SONG Fang-jie1，2，WANG Lian-sheng1，LUO Liang1，WANG Chang-an1，LI Jin-nan1，DU Xue1，XU Qi-you1

(1.HeilongjiangRiverFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Harbin150070，China；2.WuxiFisheriesCollege，NanjingAgriculturalUniversity，Wuxi214182，Jiangsu，China)

This study aimed to investigate the effects of Gln and its precursors on digestive enzyme and Na+/K+-ATPase activities of intestine inCyprinuscarpio.Seven isoproteic and isolipidic diet treatments including glucose (control)，glutamine (Gln)，glusate (Glu)，α-ketoglutarate (AKG)，L-ornithine-α-ketoglutarate (OKG)，L-arginine-α-ketoglutarate (AAKG) and α-ketoglutarate sodium (2Na-AKG) were conducted.Healthy carps with an average initial weight of (40.27 ± 3.96) g were randomly assigned to thirty-five aquaria with an initial stocking density of 30 fish per aquarium and cultured for 56 days.The results showed the protease activities in the foregut of fish in the Glu group were significantly higher than that in the control.The protease activities in the midgut of fish in the Gln group，Glu group，AAKG group and OKG group were significantly higher than those in the control.The lipase activities in the foregut of fish in the 2Na-AKG group were significantly higher than that in the control and OKG group，while the lipase activities in the midgut of fish in the 2Na-AKG group were significantly higher than that in the control and Gln group.The amylase activities in the foregut of fish in the 2Na-AKG group were significantly higher than that in the control and Gln group.The activities of Na+/K+-ATPase in the foregut of fish in the Gln group and Glu group were significantly higher than those in the control.The activities of Na+/K+-ATPase in the midgut of fish in all the treatments were significantly lower than that in the control.The activities of Na+/K+-ATPase in the hindgut of fish in Glu group，AKG group and OKG group were significantly higher than those in the control，while the activities of Na+/K+-ATPase in the hindgut of fish in Gln group，AAKG group and 2Na-AKG group were significantly lower than those in the control.The protease activities in fish can be significantly improved when Gln，Glu，OKG and AAKG were added to feed，while the lipase and amylase activities in fish can be significantly improved when 2Na-AKG were added to feed.

glutamine；precursor；Cyprinuscarpiospecularis；digestive enzyme；Na+/K+-ATPase

2017-04-24；

2017-08-03

中國水產科學研究院基本科研業務費資助(2016HY-ZD0602；2016HY-JC02-02；2014A08XK03)；國家大宗淡水魚產業技術體系(CARS-46)；國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAD25B09)

趙志剛(1982- )，男，助理研究員，博士，主要研究方向為水產養殖生態。E-mail：zhaozhigang@hrfri.ac.cn

徐奇友。E-mail：xuqiyou@sina.com

S963.73

A

1000-6907-(2017)06-0088-06