養殖水體鄰苯二甲酸二乙酯暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質酶的影響

高平章,齊 肖,謝曉蘭,黃曉平,林惠彬

(1.泉州師范學院化工與材料學院，福建泉州 362000；2.惠安縣凈峰鎮政府，福建惠安 362100)

養殖水體鄰苯二甲酸二乙酯暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質酶的影響

高平章1,齊 肖1,謝曉蘭1,黃曉平1,林惠彬2

(1.泉州師范學院化工與材料學院，福建泉州 362000；2.惠安縣凈峰鎮政府，福建惠安 362100)

鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)是常用的塑化劑，也是環境廣泛存在的內分泌干擾物。采用酶促反應動力學法及實時熒光定量PCR檢測分析養殖水體DEP暴露對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)殼膜幾丁質酶的比活力和酶系列基因mRNA表達量的影響。結果顯示不同濃度組的DEP暴露對殼膜幾丁質酶比活力的影響不具有顯著性；10 μg/L DEP暴露120 h后，對蝦殼膜幾丁質酶系的LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個基因的mRNA表達量均被顯著抑制，但隨著暴露時間延長，這種顯著性差異轉化成非顯著性；而20 μg/L DEP脅迫對LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個基因的mRNA表達量沒有顯著性影響，不同濃度組的DEP暴露不同時間后對LV-CHT5、LV-CHT6兩個基因的mRNA表達量也均不具有顯著性影響。

鄰苯二甲酸二乙酯；凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)；殼膜幾丁質酶；酶比活力；酶mRNA表達量

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦、萬氏對蝦等，原產于秘魯北部至墨西哥桑諾拉一帶的太平洋沿岸水域，生長于熱帶、亞熱帶、暖溫帶、溫帶海域。隨著人工養殖大規模增加，凡納濱對蝦已成為世界對蝦養殖產量最高的三大品種之一。泉州地處沿海地區水產養殖業比較發達，但養殖環境的污染特別是水質中嚴重超標的金屬離子、有機化合物等都將引起對蝦體內生理生化的變化，導致對蝦蛻殼困難、生長滯緩、患病率和死亡率升高等問題的出現，造成了巨大的經濟損失[1]。

鄰苯二甲酸酯類(Phthalic Acid Esters，簡稱PAEs)又稱酞酸酯，作為塑化劑被廣泛應用于塑料、涂料、醫藥、化妝品等產品。研究發現PAEs類化合物是一類環境內分泌干擾物，具有雌激素樣活性，能對生物的正常行為及生殖、發育相關的激素代謝過程產生影響，其在環境中富集和隨食物鏈遷移將成為水生動物乃至人類的潛在威脅[2]。鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)是美國國家環保局(EPA)列出的6種優先控制的PAEs有毒污染物之一，也是我國確定的3種PAEs環境優先控制污染物之一[3]。我國水體的PAEs檢出率較高，其中福建九龍江水樣含有多種PAEs類化合物，最主要的污染物是鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP) 和DEP，含量分別達17.2 和11.7 μg/L[4]。泉州灣表層海水中各種PAEs類化合物含量均值為82.28 ng/L，DBP、DEP 和鄰苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯(DEHP)是主要成分，占總含量的71.15%[5]。水生動物對PAEs 有較強的生物富集能力，故近年來關于PAEs在水產品中的富集及毒性報道不少，姜琳琳[6]調查了閩南沿海地區各類水產品中的PAEs殘留水平，發現海水魚類、淡水魚類、蝦類、蟹類、貝類等水產品體內均含有不同量的PAEs，殘留量為貝類>淡水魚>蝦≈蟹>海水魚。王興強等[7]研究發現DEP暴露會導致凡納濱對蝦血清蛋白含量、血清酚氧化酶和超氧化歧化酶活性降低，蝦免疫能力與存活率下降。但目前未見DEP等PAEs污染物對凡納濱對蝦健康發育密切相關的幾丁質酶系的影響研究。幾丁質酶是多基因家族，廣泛分布在蝦蟹等甲殼動物的內臟、殼膜等組織中，與甲殼動物的蛻殼、孵化、食物消化及抗菌防御等密切相關。研究人員已克隆出7個凡納濱對蝦幾丁質酶基因(LV-CHT1、LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT4、LV-CHT5、LV-CHT6、LV-CHT7)，并分析該基因家族各成員的功能分工，LV-CHT1、LV-CHT3和LV-CHT4基因編碼的幾丁質酶不僅具有消化酶的功能，還與抗病防御和圍食膜蛻換有關；LV-CHT2、LV-CHT6和LV-CHT7基因編碼的幾丁質酶與對蝦的周期性蛻殼密切相關；LV-CHT5基因編碼的幾丁質酶與對蝦的先天免疫有關[8-9]。本實驗通過凡納濱對蝦養殖水體的DEP暴露實驗，采用酶促反應動力學法及實時熒光定量PCR檢測對蝦殼膜幾丁質酶比活力及酶系列基因 mRNA表達量變化，研究結果將闡明DEP對與對蝦蛻殼生長發育密切相關的殼膜幾丁質酶系的影響機制，同時有助于了解DEP暴露對對蝦的毒理機制及為養殖水體塑化劑的監控提供理論指導。

1 實驗材料與方法

1.1實驗材料與試劑

實驗材料：凡納濱對蝦(購于泉州秀土對蝦養殖場)，體長約(9.0±1.0) cm

實驗試劑：考馬斯亮藍G-250(國藥集團化學試劑有限公司)；鄰苯二甲酸二乙酯(國藥集團化學試劑有限公司)；牛血清白蛋白(上海藍季科技發展有限公司)；葡萄糖(天津市福晨化學試劑廠)；其他化學試劑均為西隴化工股份有限公司。使用的蒸餾水均為玻璃重蒸水。RNA提取試劑盒(OMEGA bio-tek公司)；5×PrimeScript Buffer(TaKaRa公司)；Taq酶(TaKaRa公司)；相關引物均為上海生物工程股份有限公司合成。Beta-actin基因引物：Beta-actin-F：5′-TACACCTTCACGACCACCGC-3′、Beta-actin-R：5′-TCTCCAGCGAGGAGGAGGAA-3′ ；幾丁質酶系基因引物：

LV-CHT2-F:5′-CGGCAAGTACAGACCTGAAGACAT-3′

LV-CHT2-R:5′-AATCATAATCAGCCCAAGTGTCGTG-3′

LV-CHT3-F:5′-AACACCTCCGGCGGTTACAA-3′

LV-CHT3-R:5′-ACACCGAAGCCCAATCG-3′

LV-CHT5-F:5′-TGTCTCCGCTTTGGTGAGG-3′

LV-CHT5-R:5′-ATGGTGGTGGGCGTATTGTT-3′

LV-CHT6-F:5′-CGCTTTCATCCAACACCACC-3′

LV-CHT6-R:5′-CCTCGCGGAGTTCCTTAACC-3′

LV-CHT7-F:5′-CTTGTTCCAGATGGCACTGTATTT-3′

LV-CHT7-R:5′-TGGTTCTTGTTCAGGTGTCTTTTC-3′)

1.2實驗方法

1.2.1 凡納濱對蝦DEP暴露實驗

養殖場購置對蝦在實驗室馴養穩定后，挑選同一生長期的對蝦在50 cm×35 cm×30 cm的養殖桶中進行暴露養殖。暴露養殖條件：養殖桶放水體20 L，對蝦50尾，水溫為(22±1) ℃，鹽度為10，pH值為7.6，DEP 暴露濃度分別為0(對照)、10、20 μg/L，每個濃度設3個平行組。實驗期間，每天持續增氧，定時換水。暴露120 h、240 h后分別取樣備用。

1.2.2 凡納濱對蝦殼膜幾丁質酶的抽提制備

凡納濱對蝦在1.2.1的暴露養殖條件下暴露一定時間后，每個濃度組取6條蝦，用蒸餾水將蝦體沖洗干凈，用吸水紙吸干蝦體表面水分后，分別取殼膜，研磨均勻，加入預冷的Tris-HCl(pH7.5)緩沖液1 mL，4 ℃下抽提1 h后，12 000 r/min冷凍離心20 min，收集上清液得幾丁質酶粗酶液，冷凍備用。

1.2.3 酶蛋白濃度、酶活力及酶比活力測定

按考馬斯亮藍法[10]，采用試劑空白，用UV-1800紫外分光光度計測定不同濃度標準蛋白(牛血清白蛋白)溶液經染色反應后在595 nm下的吸光度值(OD值)，以標準蛋白含量(μg)為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，回歸得標準曲線方程為：Y=4.6×10-3×X,R2= 0.992 3。根據標準曲線測定方法和標準曲線方程測定酶蛋白溶液。

[11]，以N-乙酰氨基葡萄糖作標準物，采用DNS法測定還原糖濃度，以N-乙酰氨基葡萄糖含量(mg)為橫坐標，500 nm處的吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，回歸標準曲線得方程Y=1.25X，R2= 0.998。根據參考文獻[12]，往0.5 mL 0.1 mol/L pH 6.0磷酸緩沖液中加入等體積的1% 膠體幾丁質溶液，混勻后在45 ℃下預熱10 min，加入0.3 mL幾丁質酶液和0.2 mL蒸餾水，反應1 h后，沸水浴20 min終止反應，并迅速冷卻后加入1.5 mL DNS試劑，再沸水浴20 min后，冷卻至室溫再用蒸餾水定容至25 mL，搖勻后離心取上清，試劑空白，在500 nm下測吸光度，根據還原糖標準曲線換算酶解產物N-乙酰氨基葡萄糖含量。以N-乙酰氨基葡萄糖的生成速度來衡量幾丁質酶活性大小。

酶活力單位(u)的定義：在溫度45 ℃、pH 6.0的測活條件下，每小時水解膠體幾丁質生成1 μg N-乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量為一個活力單位；比活力定義為每毫克酶蛋白具有的酶活力單位數。

1.2.4 總RNA提取、純化與反轉錄

快速取殼膜的一小部分(大約100 mg)加入1 mL RNA-Slove regent和3顆鋼珠，用勻漿機勻漿三分鐘，4 ℃放置30 min，加入200 μL氯仿，混勻，在冰上放置10 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液加入250 μL無水乙醇混勻，用HiBind RNA Spin柱子過濾，分別用300 mL與400 mL Wash Buffer I、兩次500 mL Wash Buffer II各沖洗柱子，并在10 000 r/min離心1 min去除濾液，在14 000 r/min離心2 min甩干，用40 μL DEPC-水將mRNA溶解轉移至新的離心管中，即得到總RNA。用微量核酸蛋白分析儀測定RNA濃度。

RT-PCR反應體系：2 μL的5×PrimeScript Buffer(含有PrimeScriptRTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反應Buffer)，500 ng RNA，最后用DEPC-水補足至10 μL，反應條件為：37 ℃反轉錄15 min，85 ℃反轉錄酶失活5 s。在該反轉錄體系及條件下反轉錄得cDNA。

1.2.5 幾丁質酶的實時熒光定量PCR及mRNA相對表達量測定

在LightCycle 480 II實時熒光定量PCR儀進行擴增。反應體系為：Taq酶(含有TaKaRa Ex Taq HS DNA Polymerase,dNTP mixture,Mg2+,Tli RNaseH和SYBR Green I.)10 μL，前后引物各0.8 μL(0.4 μmol/L)，DEPC-水6.4 μL，cDNA模板2 μL，反應條件為95 ℃預變性30 s，共1個循環；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，共40個循環。

1.2.6 DEP暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質酶系基因的mRNA表達量影響測定

按1.2.1暴露方法進行暴露實驗，暴露一定時間后，每個濃度組取6條蝦(同1.2.2的對蝦樣品)，用蒸餾水將蝦體沖洗干凈，用吸水紙吸干蝦體表面水分后，快速取蝦殼的一小部分，按1.2.4方法提取mRNA并反轉錄為cDNA，按1.2.5方法分別對凡納濱對蝦的內參基因Beta-actin和幾丁質酶系基因LV-CHT1、LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT4、LV-CHT5、LV-CHT6、LV-CHT7進行實時熒光定量PCR，PCR反應結束，記錄其復制次數。以Beta-actin為內參，根據文獻[13]公式CT=(CT,Target-CT,Actin)Time x-(CT,Target-CT,Actin)Time 0，用濃度代替其中的時間即可計算在不同濃度下的CT值，再計算即可得出各基因相對擴增倍數。

1.2.7 數據處理和分析

采用 SPSS 20.0對實驗數據進行單因子方差(ANOVA)和Duncan統計分析.得到平均值和標準差 (mean±SD)，當P<0.05時，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1DEP暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質酶比活力影響

以水體終濃度分別為0、10、20 μg/L的DEP進行凡納濱對蝦暴露養殖實驗，分別在暴露120 h、240 h后取樣，分析測定殼膜幾丁質酶的比活力，由圖 1可見，與非暴露組的對蝦殼膜幾丁質酶比活力比較，養殖水體DEP暴露120 h后，暴露組的殼膜幾丁質酶比活力隨著DEP暴露濃度增大出現先下降后回升的趨勢，10 μg/L的DEP使對蝦殼膜幾丁質酶比活力下降了32.4%，但20 μg/L的DEP暴露下，對蝦殼膜幾丁質酶比活力基本沒有變化，統計分析各濃度組幾丁質酶比活力差異不具有顯著性。但隨著DEP暴露時間的延長，當暴露240 h后，DEP的脅迫激活了對蝦殼膜幾丁質酶比活力，10、20 μg/L的DEP 分別使幾丁質酶比活力上升了138.7%、71.0%，但這種激活作用也沒有顯著性。

圖1 DEP暴露不同時間后凡納濱對蝦殼膜幾丁質酶比活力比較.

2.2DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質酶系基因的mRNA表達量影響

通過凡納濱對蝦養殖水體的DEP暴露實驗，采用實時熒光定量PCR分別檢測對蝦殼膜幾丁質酶系基因LV-CHT1、LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT4、LV-CHT5、LV-CHT6、LV-CHT7的 mRNA表達量變化，結果表明，DEP暴露前后，凡納濱對蝦殼膜部位均檢測不到LV-CHT1和LV-CHT4基因的表達；但能檢測到LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT5、LV-CHT6和LV-CHT7基因的表達，且在不同濃度的DEP暴露不同時間后，各基因的mRNA表達量均發生不同程度變化。

2.2.1 DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質酶LV-CHT2基因的mRNA表達量影響

凡納濱對蝦分別在含不同濃度DEP的養殖水體中暴露不同時間后取樣，分析測定殼膜幾丁質酶LV-CHT2基因的mRNA表達量。圖 2結果顯示，與對照組相比較，凡納濱對蝦在含不同濃度DEP的水體中脅迫養殖120 h與240 h后，殼膜幾丁質酶LV-CHT2基因的mRNA表達量均呈現先抑后揚趨勢。與其它濃度組相比，10 μg/L的DEP脅迫120 h后讓殼膜幾丁質酶LV-CHT2基因的mRNA表達量出現顯著性下降，而20 μg/L的DEP脅迫120 h則使mRNA表達量上升，這種上升趨勢與空白對照組比較不具有顯著性，但與10 μg/L濃度組相比具有顯著性。DEP暴露240 h后，10 μg/L的DEP使殼膜幾丁質酶LV-CHT2基因的mRNA表達量明顯下降，而20 μg/L的DEP使mRNA表達量大幅上升，但統計分析顯示各濃度組間不存在顯著性差異。

圖2 DEP暴露對凡納濱對蝦幾丁質酶LV-CHT2基因的mRNA表達量影響.

2.2.2 DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質酶LV-CHT3基因的mRNA表達量影響

由圖3可見，與對照組相比較，凡納濱對蝦在含不同濃度DEP的水體中脅迫養殖120 h與240 h后，殼膜幾丁質酶LV-CHT3基因的mRNA表達均被抑制。與其它濃度組相比，對蝦在10 μg/L的DEP水體中脅迫120 h后，殼膜幾丁質酶LV-CHT3基因的mRNA表達量出現顯著性大幅度下降，20 μg/L的DEP脅迫120 h也使mRNA表達量下降，這種下降趨勢與空白對照組比較不具有顯著性，但與10 μg/L濃度組相比具有顯著性。DEP暴露240 h后，與對照組相比，不同濃度暴露組的殼膜幾丁質酶LV-CHT3基因的mRNA表達受抑制程度相當，且抑制趨勢均不具有顯著性。

圖3 DEP暴露對凡納濱對蝦幾丁質酶LV-CHT3基因的mRNA表達量影響

2.2.3 DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質酶LV-CHT5基因的mRNA表達量影響

由圖4可知，與對照組相比較，凡納濱對蝦分別在含10、20 μg/L的DEP水體中脅迫養殖120 h后，殼膜幾丁質酶LV-CHT5基因的mRNA表達均被小幅抑制，且抑制程度相當，統計分析表明不同濃度組間的mRNA表達量不具有顯著性差異。而凡納濱對蝦分別在含10、20 μg/L的DEP水體中脅迫養殖240 h后，殼膜幾丁質酶LV-CHT5基因的mRNA表達均被小幅激活，且激活程度相當，統計分析表明不同濃度組間的mRNA表達量同樣不具有顯著性差異。

圖4 DEP暴露對凡納濱對蝦幾丁質酶LV-CHT5基因的mRNA表達量影響.

2.2.4 DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質酶LV-CHT6基因的mRNA表達量影響

圖5結果顯示，與對照組相比較，凡納濱對蝦在含不同濃度DEP的水體中脅迫養殖120 h后，殼膜幾丁質酶LV-CHT6基因的mRNA表達呈現先激活后抑制趨勢。與對照組比較，10 μg/L的DEP脅迫120 h后使殼膜幾丁質酶LV-CHT6基因的mRNA表達量上升了72.4%；而20 μg/L的DEP使mRNA表達量下降了25.8%，進一步統計分析比較不同濃度組間的表達量差異，結果表明不具有顯著性。當DEP暴露延長至240 h后，與對照組比較，不同濃度暴露組均因DEP的脅迫使殼膜幾丁質酶LV-CHT6基因的mRNA表達被激活，激活程度隨著DEP濃度增大而增大，但激活趨勢不具有顯著性。

圖5 DEP暴露對凡納濱對蝦幾丁質酶LV-CHT6基因的mRNA表達量影響.

2.2.5 DEP暴露對對蝦殼膜幾丁質酶LV-CHT7基因的mRNA表達量影響

由圖6可見，與對照組相比較，凡納濱對蝦在含10 μg/L 的DEP水體中脅迫養殖120 h后，殼膜幾丁質酶LV-CHT7基因的mRNA表達被顯著性抑制，表達量下降了57.0%。而20 μg/L的DEP脅迫120 h后也使殼膜幾丁質酶LV-CHT7基因的mRNA表達量下降了14.0%，但這種下降趨勢與其它濃度組相比不具有顯著性。凡納濱對蝦在含不同濃度DEP中暴露240 h后，LV-CHT7基因的mRNA表達量也均受到不同程度抑制，10 μg/L的DEP對LV-CHT7基因的mRNA表達抑制程度比20 μg/L的DEP抑制程度大，但不同濃度的DEP脅迫對LV-CHT7基因的mRNA表達量影響均不具有顯著性。

圖6 DEP暴露對凡納濱對蝦幾丁質酶LV-CHT7基因的mRNA表達量影響.

3 討論

DEP是一種塑化劑，是生產聚氯乙烯的原料，伴隨著我國聚氯乙烯產業的發展，DEP造成的水質污染日趨嚴重。該物質已成為水環境中檢出最多的有機污染物之一[14]。王興強等[7]對凡納濱對蝦進行DEP暴露實驗，結果發現經過90 d的暴露實驗，由于蝦一直處于應激狀態，不斷消耗對蝦體內免疫因子，最終導致血清蛋白、血清酚氧化酶和超氧化歧化酶等免疫因子含量及活性下降，對蝦免疫系統崩潰，導致對蝦生理機能失調，影響對蝦生長。幾丁質酶在對蝦生長發育過程中發揮多種生化功能，具有促進幾丁質類食物消化吸收、調控圍食膜和外殼周期性蛻換及抗菌防御等作用[9]。本研究考察DEP暴露120 h和240 h對凡納濱對蝦殼膜幾丁質酶的影響，結果表明不同濃度組的DEP暴露對殼膜幾丁質酶比活力的影響不具有顯著性；但比較同一濃度組暴露不同時間的殼膜幾丁質酶比活力，結果顯示非暴露組的殼膜幾丁質酶比活力基本不變，而暴露組隨著暴露時間的延長酶比活力明顯提高，說明DEP脅迫對殼膜幾丁質酶比活力有促進作用，對蝦殼膜幾丁質酶對養殖水體DEP的存在會表現出應激反應。幾丁質酶活力變化趨勢與王興強等[7]的DEP暴露實驗后的酚氧化酶、超氧化歧化酶的變化趨勢相反，這可能與幾丁質酶具有多種生理功能作用有關，也可能與暴露時間長短有關。

為了進一步了解PAEs 對凡納濱對蝦的免疫毒性和發育毒性，故本研究進一步考察了DEP暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質酶系基因的影響。結果顯示10 μg/L DEP暴露120 h后，對蝦殼膜幾丁質酶系的LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個基因的mRNA表達量均是被顯著抑制，但隨著暴露時間延長到240 h，這種顯著性差異轉化成非顯著性；20 μg/L DEP脅迫對LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT7等三個基因的mRNA表達量沒有顯著性影響，不同濃度組的DEP脅迫對LV-CHT5、LV-CHT6等兩個基因的mRNA表達量影響也沒有顯著性。進一步分析同濃度組不同暴露時間點各個幾丁質酶基因的mRNA表達量差異，發現在整個實驗考察過程中，對照組的各個幾丁質酶基因的mRNA表達量均比較穩定，而DEP暴露組中，除了LV-CHT7基因的mRNA表達量基本不受暴露時間影響，LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT5和LV-CHT6基因的mRNA表達量均會受暴露時間影響。DEP暴露組的殼膜LV-CHT2及LV-CHT5基因的mRNA表達量均隨DEP脅迫時間延長而上調；10 μg/L DEP暴露會隨脅迫時間延長使殼膜LV-CHT3基因的mRNA表達量提高，但在20 μg/L DEP暴露過程中比較穩定；殼膜LV-CHT6基因在10 μg/L DEP暴露下，會隨脅迫時間延長mRNA表達量被輕微回調，但20 μg/L DEP則隨著暴露時間延長mRNA表達量被大幅度提高。可見，DEP暴露對對蝦殼膜各個幾丁質酶基因的mRNA表達具有影響，時間延長基本上導致LV-CHT2、LV-CHT3、LV-CHT5和LV-CHT6基因的mRNA表達量上調。Zhao等[15]研究也表明凡納濱對蝦感染白斑病毒后，體內幾丁質酶基因表達上調。Zhao等和本實驗室DEP脅迫研究結果說明，在外界脅迫影響和體內病毒感染情況下，對蝦產生的免疫反應會使體內幾丁質酶基因表達上調，這種基因表達影響將導致酶活力受影響，從而導致對蝦的蛻殼生長發育受影響。

進一步整體分析DEP暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質酶活力及基因表達影響，發現DEP暴露對酶活力及基因表達的影響趨勢基本一致，短時間低濃度DEP脅迫對對蝦殼膜幾丁質酶mRNA的表達量和比活力具有抑制現象，這應該是對蝦對外界DEP脅迫產生的應激反應。而隨著脅迫時間延長，殼膜幾丁質酶的mRNA表達量和酶比活力均出現上升趨勢，這種趨勢與王興強等[7]研究發現的免疫因子活力受DEP長期脅迫后呈現的下降趨勢相反，可見，在我們實驗考察的時間范圍內，DEP脅迫沒有引起對蝦的免疫系統崩潰，反而是啟動應激免疫調控系統，產生免疫應答反應，但這種免疫應答反應隨著暴露時間進一步延長是否將會再發生改變，這還有待今后進一步研究。

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EffectsofdiethylphthalateexposureonchitinasefromepidermisofLitopenaeusvannamei

GAO Ping-zhang1,QI Xiao1,XIE Xiao-lan1,HUANG Xiao-ping1,LIN Hui-bin2

(1.CollegeofChemicalEngineeringandMaterials,QuanzhouNormalUniversity,QuanzhouFujian362000,China; 2.JingfengTownGovernment,HuianCounty,Huian362100Fujian,China)

Diethyl phthalate (DEP) is one of the commonly used plasticizers.It is also a widespread environmental endocrine disruptors.In this paper,the effects of DEP exposure on the activity and mRNA expressions ofLitopenaeusvannameiepidermal chitinase were investigated using enzymatic reaction dynamic method and the real-time fluorescent quantitative PCR.The results showed that DEP exposure have no significant influence on the activity of epidermal chitinase.The mRNA expressions of epidermal chitinase gene such as LV-CHT2,LV-CHT3,LV-CHT7 were significantly inhibited after exposure to 10 μg/L DEP for 120 hrs.However,data significance disappeared when the exposures were continued.The 20 μg/L DEP had no significant effects on the mRNA expression of LV-CHT2,LV-CHT3 and LV-CHT7.Similar effects was observed for the mRNA expressions of LV-CHT5 and LV-CHT6 after DEP exposure.

diethyl phthalate;Litopenaeusvannamei;epidermal chitinase;enzymatic activity;mRNA expression

2017-03-28；

2017-09-25

國家自然科學青年基金項目(31302190)；福建省自然科學基金項目(2012J01047)；泉州市優秀人才培養專項(16D04)

高平章(1980- )，男，博士，副教授，研究方向為藥理及毒理效應研究。E-mail:gaopingzhang@126.com

謝曉蘭。E-mail:xxl_qztc@163.com

X524

A

1000-6907-(2017)06-0101-07