鈣/鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ抑制劑KN-93對(duì)兔心衰模型心室肌細(xì)胞晚鈉電流的影響*

劉衍冬， 顏素娟， 閆雙冰， 董泉彬， 鄭安財(cái)， 李 凡， 裴兆輝， 李菊香△

(1南昌市第三醫(yī)院心內(nèi)二科, 2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 3南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江西 南昌 330006)

鈣/鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ抑制劑KN-93對(duì)兔心衰模型心室肌細(xì)胞晚鈉電流的影響*

劉衍冬1， 顏素娟2， 閆雙冰3， 董泉彬3， 鄭安財(cái)3， 李 凡3， 裴兆輝1， 李菊香2△

(1南昌市第三醫(yī)院心內(nèi)二科,2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，3南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江西 南昌 330006)

目的探討異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)誘導(dǎo)兔心衰(heart failure，HF)時(shí)，兔心室肌細(xì)胞晚鈉電流(late sodium current，INaL)的變化及鈣/鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)抑制劑KN-93對(duì)INaL的影響。方法經(jīng)兔耳緣靜脈注射ISO (300 μg·kg-1·d-1，連續(xù)15 d)誘導(dǎo)兔HF模型；1月后行心臟彩超檢查和HE染色觀察心肌形態(tài)改變來(lái)評(píng)價(jià)HF模型；Western blot分析NaV1.5、CaMKⅡδ和磷酸化CaMKⅡδ的蛋白水平；經(jīng)Langendorff裝置灌注消化生理鹽水(normal saline，NS)組和HF組的兔心室肌細(xì)胞，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄INaL。結(jié)果與NS組相比，HF組兔心率增加(P<0.01),心室腔增大(P<0.05),心功能明顯降低(P<0.01)；心肌細(xì)胞排列紊亂,呈空泡樣變性,細(xì)胞間質(zhì)存在水腫,纖維組織增多。HF組的NaV1.5、CaMKⅡδ及磷酸化CaMKⅡδ的蛋白水平與NS組相比均明顯增加(P<0.01)。HF組的INaL與NS組相比明顯增加(P<0.01)；加入海葵毒素Ⅱ(sea anemone toxin Ⅱ，ATXⅡ)后，HF組及NS組INaL均明顯增加，且HF組比NS組增加更明顯(P<0.01)；在ATXⅡ誘導(dǎo)電流增加穩(wěn)定后，加入KN-93，NS組及HF組中INaL均明顯減少(P<0.05)。結(jié)論CaMKⅡ抑制劑KN-93能抑制心衰增加的INaL，這一作用可能與影響CaMKⅡδ活性及CaMKⅡδ參與INaL的調(diào)控有關(guān)。

鈣/鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ； 心力衰竭； 晚鈉電流； KN-93

心力衰竭(heart failure，HF)是各種心血管病的嚴(yán)重和終末階段，成為全世界心血管病醫(yī)生所面臨的重大挑戰(zhàn)之一。晚鈉電流(late sodium current，INaL)是由一部分特殊的內(nèi)向鈉離子通道形成的持續(xù)內(nèi)向鈉電流，而這部分特殊通道具有較緩慢失活特性，它由NaV1.5所編碼，是構(gòu)成動(dòng)作電位平臺(tái)期的主要電流之一[1-2]。正常心肌細(xì)胞只能產(chǎn)生很小的INaL，但在病理狀態(tài)下(心衰、心肌缺血等)，該電流可增大至5倍及以上[3]，明顯影響動(dòng)作電位時(shí)程，并通過(guò)多種機(jī)制產(chǎn)生心律失常。目前對(duì)INaL的電生理機(jī)制已有一定的了解，但在病理狀態(tài)下引起INaL增加的分子機(jī)制還不甚清楚。鈣/鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)是一種多功能蛋白酶，包括α、β、γ和δ 4種亞基，其中δ亞基是心肌細(xì)胞中CaMKⅡ的主要成分[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)HF與CaMKⅡδ有著密切聯(lián)系，并與心律失常發(fā)生有關(guān)[5-6]。本文擬研究兔HF時(shí)心室肌細(xì)胞INaL和CaMKⅡδ蛋白的變化及CaMKⅡ抑制劑KN-93對(duì)INaL的影響,旨在揭示HF時(shí)影響INaL變化的分子機(jī)制，為臨床醫(yī)務(wù)人員防治心衰患者心律失常提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)和新思路。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用日本長(zhǎng)耳白兔，體重1.7～2.0 kg，2～3月齡，購(gòu)于南昌龍平兔業(yè)有限公司，許可證號(hào)為SCXK(贛)2014-0005。

2主要試劑和儀器

異丙腎上腺素(isoproterenol, ISO; 上海喬豐制藥公司)；戊巴比妥鈉和膠原酶Ⅱ(Sigma)；KN-93、海葵霉素Ⅱ(sea anemone toxin Ⅱ，ATXⅡ)和抗磷酸化CaMKⅡδ單克隆抗體(Abcam)；抗NaV1.5抗體和抗GAPDH抗體(Proteintech)；抗CaMKⅡδ多克隆抗體(GeneTex)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Thermo scientific);其它分析純購(gòu)買(mǎi)于天津大茂化學(xué)試劑廠。多普勒超聲診斷儀(PHILIP)；Langendorff裝置(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技公司)；EPC10 膜片鉗系統(tǒng)(HEKA)；Western blot電泳儀(Bio-Rad)。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1兔心衰模型的建立 將日本大耳白兔隨機(jī)分為HF組和生理鹽水(normal saline，NS)組，每組12只。HF組兔固定后經(jīng)耳緣靜脈注射ISO (300 μg·kg-1·d-1)，注意觀察有無(wú)不良反應(yīng)，連續(xù)注射15 d； NS組兔固定后經(jīng)耳緣靜脈注射等體積的NS (1 mL·kg-1·d-1)，連續(xù)注射15 d。各組每次藥物注射后，觀察兔基本情況，并自由進(jìn)食給水。

3.2兔心臟彩超檢查 NS組和HF組兔于開(kāi)始建模1月后行心臟彩超檢查。經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉(程度淺)后，胸前備皮，仰臥于超聲診斷床上。使用多普勒超聲診斷儀，分別獲得左房前后內(nèi)徑(left atrial dimension，LAD)、左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension， LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systo-lic dimension，LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)等指標(biāo)。

3.3兔心肌組織的HE染色 取兔左心室心肌組織浸沒(méi)于4%多聚甲醛溶液24 h，常規(guī)脫水、包埋、切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌形態(tài)變化。

3.4Western blot實(shí)驗(yàn) 心肌組織中加入裂解液提取總蛋白，按BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白樣品，SDS-PAGE后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，加入按相應(yīng)比例稀釋的I抗，4 ℃孵育過(guò)夜。經(jīng)TBST洗膜除去過(guò)量的 I 抗，然后加入Ⅱ抗，室溫孵育2 h。然后進(jìn)行曝光顯影，采用Image LabTM軟件計(jì)算曝光條帶光密度值及數(shù)據(jù)分析，以GAPDH為內(nèi)參照。

3.5兔心室肌細(xì)胞的分離 兔經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，將心臟取出懸掛于Langendorff裝置上用無(wú)鈣臺(tái)式液灌流(65 r/min)3～4 min。當(dāng)灌流出來(lái)的液體變干凈，將含膠原酶Ⅱ(0.4 g/L)和BSA(1 g/L)的無(wú)鈣臺(tái)式液加到灌注系統(tǒng)灌注消化18 min。將消化后的心臟取下，剪下靠心尖部的左心室組織并剪碎，過(guò)濾離心保存于KB液(含2 g/L BSA)中備用。

3.6全細(xì)胞膜片鉗記錄 實(shí)驗(yàn)在環(huán)境溫度為20～25 ℃下進(jìn)行，取適量兔心室細(xì)胞懸液于3.5 cm平皿中，待細(xì)胞沉降貼壁后，顯微鏡下選取表面光滑、心肌橫紋清晰、無(wú)收縮活動(dòng)的細(xì)胞，用全細(xì)胞膜片鉗記錄電流。用正常或加有相應(yīng)藥物的細(xì)胞灌流液以2 mL/min速度進(jìn)行充灌玻璃微電極正壓入水，電極入水阻抗值在4～5 ΜΩ之間。利用電動(dòng)三維顯微操縱儀移動(dòng)玻璃微電極至細(xì)胞表面，然后用1 mL注射器給予負(fù)壓封接心肌細(xì)胞，維持封接電阻大于1 GΩ，封接結(jié)束，然后完成電極電容補(bǔ)償，此時(shí)就形成全細(xì)胞的記錄模式。然后進(jìn)行信號(hào)采集。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，同一樣本處理前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用Bonferroni檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1建模結(jié)果

1.1建模前后心室率的比較 與NS組相比，HF組兔建模后的心室率增加明顯(P<0.01)，見(jiàn)表1。

1.2心臟彩超結(jié)果 心臟彩色超聲圖顯示，與NS組相比，HF組LAD和LVEDD有所增大(P<0.05)，LVESD明顯增大(P<0.01)，而LVEF和LVFS均明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)圖1、表2。

表1兩組兔建模前后心率的比較

Table 1. Comparison of the heart rate between the 2 groups before and after modeling (min-1. Mean±SD.n=12)

GroupBeforemodelingAftermodelingNS225．2±9．0230．8±9．5HF223．2±11．4273．4±14．6??

**P<0.01vsNS group.

Figure 1. The results of rabbit heart echocardiography. A: NS group; B: HF group.

圖1兔心臟彩超結(jié)果

表2 兩組兔心臟彩超結(jié)果

LAD: left atrial dimension; LVEDD: left ventricular end-diastolic dimension; LVESD: left ventricular end-systolic dimension; LVEF: left ventricular ejection fraction; LVFS: left ventricular fractional shortening.*P<0.05,**P<0.01vsNS group.

1.3心肌組織HE染色的形態(tài)變化 HE染色發(fā)現(xiàn)，NS組心肌細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,平行排列,細(xì)胞之間的界限清楚，細(xì)胞核呈橢圓形,可見(jiàn)心肌橫紋；HF組心肌細(xì)胞排列紊亂、無(wú)規(guī)則,心肌細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性,細(xì)胞間質(zhì)存在水腫,纖維組織增多，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The morphological changes of rabbit left ventricular tissues with HE staining (scale bar=50 μm). A: NS group; B: HF group.

圖2兔左心室組織HE染色的形態(tài)變化

2兩組兔心室組織NaV1.5、CaMKⅡδ和磷酸化CaMKⅡδ的蛋白水平變化

Western blot結(jié)果顯示，與NS組相比，HF組心室肌組織NaV1.5、CaMKⅡδ和磷酸化CaMKⅡδ蛋白水平明顯增加(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The protein levels of NaV1.5, CaMKⅡδ and phosphorylated CaMKⅡδ (p-CaMKⅡδ) in the rabbit left ventricular tissues. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNS group.

圖3兔心室組織NaV1.5、CaMKⅡδ和磷酸化CaMKⅡδ的蛋白水平變化

3兩組兔心室肌細(xì)胞的INaL及KN-93對(duì)INaL的影響

維持鉗制電位為-80 mV，給予-10 mV、持續(xù)時(shí)程為100 ms去極化電脈沖刺激可以記錄到INaL。電流穩(wěn)定后，所記錄HF組INaL(-1.70 pA/pF±0.20 pA/pF)與NS組(-0.66 pA/pF±0.14 pA/pF)相比明顯增加(P<0.01)。加入30 nmo/L ATXⅡ后，INaL均有所增加(P<0.01)，且HF組比NS組增加更明顯(P<0.01)。在ATXⅡ誘導(dǎo)電流增加穩(wěn)定后，在兩組心室肌細(xì)胞灌流液中加入1 μmo/L KN-93，INaL會(huì)降低；NS組中經(jīng)ATXⅡ誘導(dǎo)增加的INaL由(-1.39 pA/pF±0.29 pA/pF)減少至(-0.89 pA/pF±0.12 pA/pF)(P<0.05)；HF組中經(jīng)ATXⅡ誘導(dǎo)增加的INaL由(-2.36 pA/pF±0.12 pA/pF)減少至(-1.93 pA/pF±0.15 pA/pF)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4、5。

Figure 4. The recordedINaLof rabbit ventricular myocytes after drug treatments. A: NS group; B: HF group. NS group and HF group each had 6 rabbits, with 3 cells in each treatment group.

圖4兔心室肌細(xì)胞經(jīng)藥物處理后記錄的INaL

Figure 5. The changes ofINaLdensity in the rabbit ventricular myocytes after drug treatments. A: NS group; B: HF group; C: NS group and HF group. Mean±SD. NS group and HF group each had 6 rabbits, with 3 cells in each treatment group.##P<0.01vscontrol group;△P<0.05vsATXⅡ group;**P<0.01vsNS group.

圖5兔心室肌細(xì)胞經(jīng)藥物處理后INaL的變化

討 論

目前針對(duì)HF的治療有了很大的進(jìn)展，但HF在心血管疾病中仍是主要的死亡原因。建立一種穩(wěn)定的HF動(dòng)物模型能為研究HF的病理生理機(jī)制、臨床預(yù)防及治療提供基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)兔耳緣靜脈注射ISO誘導(dǎo)兔HF模型，其機(jī)制為：ISO為β受體激動(dòng)劑，可增強(qiáng)心肌收縮力并提高心室率，以提高心排血量；但與此同時(shí)會(huì)引起周?chē)苁湛s，增加心臟后負(fù)荷，再加上心室率增加，這些均使心臟耗氧量增加，然而長(zhǎng)期應(yīng)用ISO可導(dǎo)致心肌細(xì)胞纖維化、凋亡及變性壞死，并使心室發(fā)生重構(gòu)[7]，最終發(fā)生HF[8]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HF組兔心室肌組織NaV1.5、CaMKⅡδ和磷酸化CaMKⅡδ的蛋白水平明顯增加；且兔HF時(shí)由NaV1.5所介導(dǎo)的INaL也明顯增加，這與Valdivia等[9]的結(jié)論一致。分別在HF組和NS組心室肌細(xì)胞加入ATXⅡ誘導(dǎo)INaL增加穩(wěn)定后，再加入CaMKⅡ抑制劑KN-93，發(fā)現(xiàn)INaL會(huì)明顯下降，說(shuō)明抑制CaMKⅡδ能降低INaL。近期研究發(fā)現(xiàn)使用KN-93抑制CaMKⅡ的表達(dá)后，可有效減少HF時(shí)室性心律失常的發(fā)生[10-11]。純化的CaMKⅡ幾乎沒(méi)有活性，主要通過(guò)CaMKⅡ依賴(lài)Ca2+-CaM途徑來(lái)激活。研究發(fā)現(xiàn)心肌中以CaMKⅡδ為主，CaMKⅡδ參與Ca2+依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以發(fā)生磷酸化來(lái)調(diào)控細(xì)胞胞質(zhì)中的鈣調(diào)蛋白，進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)，從而在HF及心律失常發(fā)生中起著重要的作用[5-6, 12]。HF發(fā)生時(shí)，交感神經(jīng)的興奮增強(qiáng)，通過(guò)腎上腺素能受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化PKA，使肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放通道的磷酸化水平升高，使經(jīng)蘭尼定受體(ryanoine receptor，RyR)的Ca2+釋放增多引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加；另一方面，HF時(shí)，INaL成倍地增加，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Na+平衡紊亂，再通過(guò)反向型鈉-鈣交換體將Na+轉(zhuǎn)出細(xì)胞，而將Ca2+移入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生Ca2+超載。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加會(huì)通過(guò)Ca2+-CaM途徑來(lái)激活CaMKⅡδ，并增加CaMKⅡδ的活性。Awad等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HF發(fā)生時(shí)心肌CaMKⅡδ表達(dá)增加會(huì)進(jìn)一步加重HF。NaV1.5是心肌細(xì)胞中重要的通道蛋白，能介導(dǎo)INaL。在心臟組織中NaV1.5表達(dá)異常，會(huì)引起INaL改變。HF時(shí)，增加的INaL能減少凈復(fù)極化電流，同時(shí)流入細(xì)胞內(nèi)的Na+增加產(chǎn)生除極，從而延長(zhǎng)動(dòng)作電位平臺(tái)期，使動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，容易誘發(fā)早后除極和延遲后除極[14-15]，從而產(chǎn)生心律失常。Hashambhoy等[16]發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中激活的CaMKⅡδ能調(diào)節(jié)Na+通道，而激活的CAMKⅡδ也可使肌漿網(wǎng)內(nèi)經(jīng)RyR開(kāi)放，進(jìn)而導(dǎo)致肌漿網(wǎng)自發(fā)釋放Ca2+產(chǎn)生鈣瞬時(shí)，誘發(fā)心律失常。由此可見(jiàn)，KN-93通過(guò)抑制CaMKⅡδ降低INaL來(lái)減少心律失常的發(fā)生，而抑制CaMKⅡδ可能成為HF患者抗心律失常藥物研究的一個(gè)新靶點(diǎn)。

總之，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ抑制劑KN-93能抑制心衰增加的INaL，這一作用可能與影響CaMKⅡδ活性及CaMKⅡδ參與INaL的調(diào)控有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡinhibitor KN-93 on late sodium current in rabbits model of heart failure

LIU Yan-dong1, YAN Su-juan2, YAN Shuang-bing3, DONG Quan-bin3, ZHENG An-cai3, LI Fan3, PEI Zhao-hui1, LI Ju-xiang2

(1SecondDepartmentofCardiology,TheThirdHospitalofNanchang，2DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，3SchoolofMedicine,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:ljx912@126.com)

AIM: To investigate the change of late sodium current (INaL) and the effect of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ (CaMKⅡ) inhibitor KN-93 onINaLin the cardiomyocytes after isoproterenol-induced heart fai-lure (HF) in rabbits.METHODSThe rabbit model of HF was induced by injecting isoproterenol (300 μg·kg-1·d-1) for 15 d. One month later, all rabbits

by echocardiography and HE staining to observe the morphological changes of myocardium for evaluating the HF model. The protein expression of NaV1.5, CaMKⅡδ and phosphorylated CaMKⅡδ was determined by Western blot. The ventricular myocytes were isolated from the rabbits of normal saline (NS) group and HF group by Langendorff perfusion, and the whole-cell patch-clamp technique was used to recordINaL.RESULTSCompared with NS group, the heart rate in HF group was increased (P<0.01), the ventricular cavity was enlarged (P<0.05), and the cardiac function was decreased (P<0.01). Compared with NS group, the cardiomyocytes in HF group arranged in disorder, vacuolar degeneration and myocardial interstitial edema were observed, and fibrous tissue increased. The protein levels of NaV1.5, CaMKⅡδ and phosphorylated CaMKⅡδ in HF group were higher than those in NS group (P<0.01).INaLin HF group significantly increased compared with NS group (P<0.01). After adding sea anemone toxin Ⅱ (ATXⅡ), the density ofINaLin HF group and NS group was significantly increased, but that in HF group increased more obviously than that in NS group (P<0.01). After ATXⅡ had induced stable current, we added KN-93 into NS group and HF group, and we found that the ATXⅡ-increasedINaLin NS group and HF group was significantly decreased (P<0.05).CONCLUSIONCaMKⅡ inhibitor KN-93 inhibits the increase inINaLin HF rabbits, which may be related to the activity of CaMKⅡδ and the regulation of CaMKⅡ δ onINaL.

Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ; Heart failure; Late sodium current; KN-93

1000- 4718(2017)11- 1964- 05

2017- 04- 13

2017- 07- 04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81200132)； 江西省研究生創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No. YC2014-S085)

△通訊作者 Tel: 13657092311; E-mail: ljx912@126.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.007