補陽還五湯促進內皮祖細胞修復損傷血管內皮*

張 偉， 賀 冰， 李 亮， 李 菲， 曹 浪， 劉曉丹， 鄧常清△

(1湖南中醫(yī)藥大學附屬岳陽醫(yī)院， 湖南 岳陽 414000； 2湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院， 湖南 長沙410005； 3湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院， 湖南 長沙 410208)

補陽還五湯促進內皮祖細胞修復損傷血管內皮*

張 偉1， 賀 冰2， 李 亮3， 李 菲3， 曹 浪3， 劉曉丹3， 鄧常清3△

(1湖南中醫(yī)藥大學附屬岳陽醫(yī)院， 湖南 岳陽 414000；2湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院， 湖南 長沙410005；3湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院， 湖南 長沙 410208)

目的探討補陽還五湯(BYHWD)促進內皮祖細胞(EPCs)修復損傷血管內皮的作用及相關機制。方法以補陽還五湯灌胃及EPCs尾靜脈輸注作用于內皮損傷的模型大鼠，從血管內皮的形態(tài)、功能和EPCs歸巢等方面評價內皮損傷修復情況；從血管內環(huán)境改善和基質細胞衍生因子-1(SDF-1)及其受體趨化因子受體-4相關蛋白表達了解該方促進EPCs修復受損血管的機制。結果與單用EPCs組和單用BYHWD組比較，BYHWD聯(lián)合EPCs組內膜厚度明顯減少，甘油三酯、總膽固醇及血鈣含量降低，高密度脂蛋白含量升高；此外，BYHWD聯(lián)合EPCs組血管內皮型一氧化氮合酶(eNOS)及血管SDF-1蛋白表達均顯著增加。結論補陽還五湯能促進EPCs修復損傷的血管內皮，其作用機制可能與調控內環(huán)境以及促進EPCs的歸巢有關。

補陽還五湯； 內皮祖細胞； 血管內皮； 內皮型一氧化氮合酶； 基質細胞衍生因子-1； 趨化因子受體-4

血管內皮損傷是動脈粥樣硬化等多種心腦血管疾病的始動因素和共同的病理基礎[1]。因而，及時有效地修復損傷的血管內皮是防治心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的有效手段和重要策略。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)屬于干細胞家族，是修復血管內皮的種子細胞[2]。生理條件下，骨髓和外周血中的少量EPCs可代償衰老和凋亡的血管內皮細胞以維持血管內皮的完整和生理功能，這一過程確保了血管內皮的損傷和修復的動態(tài)平衡。然而，在缺氧、炎癥和損傷等因素的刺激下激活的EPCs不足以彌補細胞的損傷當量，使得血管內皮的修復損傷平衡破壞，從而導致各種心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展。干細胞移植是治療心腦血管疾病的有效手段。輸注異體同源的EPCs可有效彌補自身EPCs的數量不足，然而種子細胞的生存依賴于快速的血管化[3]，因而促進EPCs的快速準確的歸巢具有重要的科學意義。中醫(yī)藥在防治心腦血管疾病方面積累了大量的經驗，補陽還五湯(Buyanghuanwu decoction，BYHWD)是中醫(yī)益氣活血法的代表方劑，已有研究表明該方能有效改善內皮功能，促進內皮損傷的修復[4-6]。但有關該方是否能促進EPCs對受損血管內皮的修復作用還不清楚。因此，進一步了解補陽還五湯對EPCs修復受損內皮的調控作用對于該方的合理運用具有重要的科學意義。

材 料 和 方 法

1動物

成年雄性SD大鼠，體重180～200 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號為SCXK(湘)2011-0003。實驗遵循實驗動物3R原則，并通過湖南中醫(yī)藥大學倫理委員會批準。

2主要試劑和儀器

衰老相關β-半乳糖苷酶 (senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal) 染色試劑盒(Beyotime)；DAPI (Vector Laboratories)；小鼠抗大鼠內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體和兔抗鼠β-actin單克隆抗體(Bioworld)；超敏化學發(fā)光顯色試劑盒、封閉蛋白干粉、羊抗鼠 II 抗、羊抗兔 II 抗和蛋白印跡膜再生液均購自Boster。MoFloXDP高速分選型流式細胞儀(Beckman)；DF5000B Leica熒光顯微鏡、Leica CM 1850 冰凍切片機(Leica Microsystems)；Multiskan MK3酶標儀(Thermo)。

3方法

3.1EPCs的培養(yǎng)、鑒定和標記 SD大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后頸椎脫臼處死，采用改良密度梯度離心法獲取單個核細胞培養(yǎng)[7]，72 h后半量換液，14 d左右細胞鋪滿培養(yǎng)瓶后可進行鑒定或傳代。(1)EPCs的鑒定：按照文獻方法[8-9]，完成EPCs細胞表面標志物及功能學鑒定，細胞傳代備用。(2)按照參考文獻[10]對EPCs進行標記：取培養(yǎng)14 d的EPCs，將熒光染色劑DAPI加入EPCs中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，標記后的EPCs用無菌PBS沖洗6次，除去未結合的DAPI，熒光顯微鏡下觀察標記的EPCs。

3.2血管內皮損傷模型的建立 根據文獻方法[11]建立大鼠血管內皮損傷模型，SD雄性大鼠隨機分組后，以配方為2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、3%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶和94.3 %基礎飼料的高脂飼料喂養(yǎng)12周，輔以VitD(7×105U/kg)腹腔注射(分2次注射，高脂喂養(yǎng)2周后第1次注射，2周后第2次注射，每次各半)。隨機取5只大鼠，觀察內膜形態(tài)、計量檢測內膜厚度并以SA-β-gal法檢測內皮衰老情況，可見大鼠主動脈內膜增厚，出現動脈粥樣硬化樣改變，內皮衰老檢測呈陽性，據此推測造模成功。

3.3分組、給藥及處理 模型大鼠隨機分為單用BYHWD組、單純EPCs輸注組、BYHWD聯(lián)合EPCs組和模型(model)組，并以健康SD大鼠設為對照(control)組，合計5組。按組別給予藥物處理，BYHWD和BYHWD+EPCs組以補陽還五湯灌胃(生藥11.1 g/kg， 每天1次，連用30 d)，每周稱體重調整灌胃藥量，其余各組蒸餾水灌胃。BYHWD+EPCs組和EPCs組輸注數量約為2×106以DAPI標記的EPCs，通過尾靜脈于給藥的第8天一次性輸注，其余各組輸注1 mL PBS，藥物干預30 d后處死動物取材進行檢測。

3.4血管內膜增生的測定 取胸主動脈，按以往研究方法[12]檢測血管內膜厚度以反映內皮損傷和修復情況。HE染色法觀察血管內膜形態(tài)，采用圖像分析軟件計量內膜增生情況，按組織學劃分，內彈力膜以內為內膜。以MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分別測量內膜厚度=[(內彈力膜周徑-管腔周徑)/2π]。取血管壁內膜最厚處測量，以3個不同橫截段面的平均值表示該血管的內膜厚度。

3.5內皮衰老的測定 根據文獻方法[13]測定血管SA-β-Gal活性以評價內皮衰老狀況。大鼠胸主動脈標本石蠟切片，按照常規(guī)方法進行脫蠟和水化處理后加入適量的β-半乳糖苷酶染色固定液，以充分蓋住組織為宜，室溫固定不少于15 min。用PBS浸泡洗滌組織3次，每次不少于5 min。吸除PBS，參照說明書加入適量染色工作液37 ℃孵育過夜。隨后于普通光學顯微鏡下觀察，陽性表達血管內膜可見藍色顆粒。

3.6EPCs歸巢的觀察 根據參考文獻[10]取培養(yǎng)14 d的EPCs，用熒光染色劑DAPI標記后尾靜脈輸注大鼠體內。4周后取胸主動脈標本于熒光顯微鏡下觀察EPCs在受損血管內皮的歸巢分化情況。

3.7血脂血鈣測定 大鼠連續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)12周后眼球采血測定血脂、血鈣水平[14]。

3.8血管eNOS、基質細胞衍生因子1(stromal cell-drived factor-1，SDF-1)及其受體CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor-4，CXCR-4)的蛋白表達 分組方法同前。各組大鼠于給藥30 d后即末次給藥后次日麻醉處死，取出胸腹主動脈，將組織碾磨之后收集于干凈Ep管中，Bradford 法測定蛋白含量。用SDS-PAGE法將蛋白分離后轉移至PVDF膜，加入5%蛋白封閉液在室溫下孵育2 h。分別加入3 mL 用TBST稀釋的 I 抗(eNOS 1∶500、SDF-1 1∶200、CXCR-4 1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入羊抗鼠、羊抗兔 II 抗3 mL(1∶4 000)，37 ℃孵育1 h。將膜放置于熒光成像儀內，用凝膠成像系統(tǒng)曝光后將膠片進行掃描，用圖像分析軟件IPP 6.0對圖像進行光密度分析。

4統(tǒng)計學處理

運用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0進行數據分析，實驗結果均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間均數比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，方差不齊者先將數據進行自然對數轉換后再作單因素方差分析和兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1各組大鼠血管內皮形態(tài)及內膜厚度比較

血管形態(tài)學觀察結果顯示，模型組可見血管內膜增厚，部分增厚部位出現泡沫細胞等動脈粥樣硬化樣改變，中膜萎縮，血管環(huán)狀肌層結構被破壞，表明造模成功；與模型組比較，各藥物組內膜增生和中膜萎縮狀態(tài)得到改善，其中EPCs輸注組及BYHWD聯(lián)合EPCs組改善最為顯著，見圖1。

Figure 1. Vascular morphology in each group (HE stanining, ×100).

圖1HE染色觀察各組大鼠血管形態(tài)

血管內膜厚度比較結果表明，與control組比較，model組內膜增厚(P<0.05)，提示造模后血管內皮損傷，內膜增生；與model組比較，EPCs組、BYHWD組以及BYHWD+EPCs組內膜厚度均顯著減小(P<0.05)；與EPCs組和BYHWD組比較，BYHWD+EPCs組內膜厚度減小(P<0.05)，見圖2。

2各組血管內皮衰老的比較

β-半乳糖苷酶染色結果顯示，model組可見血管內膜顯著增生，血管內膜中可見到SA-β-Gal染色陽性，呈中等強度表達，而control組表達呈陰性；與model組比較，EPCs組血管各層細胞排列整齊，血管內膜未見陽性表達，BYHWD組血管內膜可見弱陽性表達，而BYHWD+EPCs組血管內膜亦未見陽性表達，見圖3。

Figure 2. Comparison of intima thickness in different groups. Mean±SD.n=10.☆P<0.05vscontrol;△P<0.05vsmodel;▲P<0.05vsBYHWD+EPCs.

圖2各組大鼠血管內膜厚度的比較

Figure 3. Endothelial cell senescence markers in each group (SA-β-Gal staining, ×100).

圖3各組血管內皮衰老情況的比較

3EPCs的歸巢

熒光顯微鏡下BYHWD+EPCs組和EPCs組血管壁可見藍色熒光，尤其是在內膜部位及損傷嚴重部位的熒光表達更強；結合血管形態(tài)學及管壁計量檢測結果提示輸注EPCs的各組損傷修復較好，由此可知輸注的EPCs歸巢到損傷血管分化為內皮細胞參與了損傷血管內皮的修復，見圖4。

Figure 4. EPCs homing to vascular intima (fluorescence staining, ×40).

圖4熒光下各組EPCs歸巢情況

4血脂和血鈣的比較

與control組比較，model組大鼠血清中甘油三酯和總膽固醇顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示高脂喂養(yǎng)加注射維生素D導致血脂升高；與model組比較，BYHWD+EPCs組和BYHWD組均可使總膽固醇及甘油三酯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而EPCs組在上述兩個指標上與model組差異無統(tǒng)計學顯著性；與model組比較，BYHWD組和BYHWD+EPCs組高密度脂蛋白(high- density lipoprotein，HDL)的水平均能升高(P<0.05)，而EPCs組HDL無顯著變化；與EPCs組比較，BYHWD+EPCs組總膽固醇及甘油三酯降低(P<0.05)；與BYHWD組比較，BYHWD+EPCs合用降低甘油三酯、升高HDL水平的作用更為顯著(P<0.05)。血鈣結果分析表明，與control組比較，model組血鈣顯著升高(P<0.05)；各治療組與model組比較血鈣濃度顯著降低(P<0.05)；EPCs組與BYHWD+EPCs組相比，后者血鈣下降更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

5各組血管eNOS表達的比較

與control組比較，model組中eNOS蛋白表達減少；與model組比較，各實驗組eNOS表達均增強；與EPCs組和BYHWD組比較，BYHWD+EPCs組的eNOS蛋白表達顯著增加。結果表明，補陽還五湯聯(lián)合EPCs可提高eNOS蛋白表達水平，見圖6。

6各組SDF-1、CXCR-4表達的比較

與control組比較，model組SDF-1蛋白表達顯著升高；與model組比較，BYHWD+EPCs組SDF-1蛋白表達顯著升高，而EPCs組、BYHWD組與model組比較差異無統(tǒng)計學顯著性；與EPCs組和BYHWD組比較，BYHWD+EPCs組SDF-1表達顯著增高。在CXCR-4蛋白表達方面，與control組比較，model組CXCR-4表達顯著降低；與model組比較，BYHWD+EPCs組CXCR-4表達顯著降低，其它各組差異無統(tǒng)計學顯著性，但BYHWD+EPCs組與EPCs組和BYHWD組比較CXCR-4顯著降低，見圖7。

Figure 5. Comparison of serum lipids and serum calcium in different groups. Mean±SD.n=10.☆P<0.05vscontrol;△P<0.05vsmodel;▲P<0.05vsEPCs;★P<0.05vsBYHWD.

圖5各組大鼠血清中血脂和血鈣表達結果

Figure 6. The protein expression of eNOS in in different groups. Mean±SD.n=10.☆P<0.05vscontrol;△P<0.05vsmodel;▲P<0.05vsEPCs;★P<0.05vsBYHWD.

圖6各組eNOS表達結果

Figure 7. The protein expression of SDF-1 and CXCR-4 in different groups. Mean±SD.n=10.☆P<0.05vscontrol;△P<0.05vsmodel;▲P<0.05vsEPCs;★P<0.05vsBYHWD.

圖7各組SDF-1和CXCR-4的表達結果

討 論

補陽還五湯出自清代名醫(yī)王清任《醫(yī)林改錯》，具有益氣活血之功效，為治療缺血性腦血管病及后遺癥的有效方劑。已有研究表明[15-16]該方能通過增強血管內皮生長因子及其受體的表達和提高蛋白水平達到保護血管內皮的作用，并能通過各種途徑促進血管內皮細胞表達一氧化氮，從而達到保護血管內皮的作用[17]。在抗動脈粥樣硬化方面，補陽還五湯內服加外敷治療閉塞性周圍動脈粥樣硬化有顯著療效[18]。它可以通過抑制誘導型一氧化氮合酶的表達降低動脈粥樣硬化小鼠一氧化氮水平，防治動脈粥樣硬化[19]；還能下調MMP-9的表達，降低血脂，具有抗動脈粥樣化作用[20]。由此可見，該方具有較好的改善內皮功能的作用。其作用機制主要為降血脂、抗氧化損傷、調節(jié)內皮活性物質分泌、抗栓與促栓平衡和抗細胞凋亡等。

本文實驗結果表明，從血管形態(tài)學評價和血管內膜厚度比較可知，單純輸注EPCs或單用補陽還五湯可抑制內膜增生，提示EPCs和中藥復方對內皮損傷具有一定的修復作用。而補陽還五湯聯(lián)合EPCs對受損血管內皮的修復作用更強。內皮衰老形態(tài)學評價表明，補陽還五湯聯(lián)合EPCs組內皮衰老程度減輕，損傷減輕。EPCs示蹤實驗也證實，補陽還五湯聯(lián)合EPCs后，可促進EPCs在受損血管的歸巢。提示中藥復方聯(lián)合EPCs后可促進EPCs對血管內皮的修復，中藥聯(lián)合EPCs具有一定的相加作用。

血管內皮eNOS蛋白表達分析也表明，輸注EPCs、單用補陽還五湯可上調eNOS表達，促進了血管內皮功能的恢復；補陽還五湯聯(lián)合EPCs可進一步上調血管內皮eNOS表達，交互作用分析表明中藥復方聯(lián)合EPCs均具有相加作用，這也從功能上進一步證明了中藥復方有能促進EPCs修復受損血管內皮的作用，其機制可能與補陽還五湯促進EPCs向受損內皮歸巢，進而分化為成熟內皮細胞有關。

在調節(jié)血脂、血鈣方面補陽還五湯聯(lián)合EPCs的作用優(yōu)于單純EPCs組。推測補陽還五湯對血脂、血鈣具有調節(jié)作用，補陽還五湯通過對血脂、血鈣的調節(jié)，改善了機體內環(huán)境，從而可促進EPCs向受損內皮的歸巢分化，促進受損內皮的修復。

為進一步了解補陽還五湯與EPCs的關系，本研究還從分子機制進行了研究探討。研究表明SDF-1/CXCR-4軸在內皮祖細胞的歸巢、動員和分化中發(fā)揮著關鍵作用[21]。SDF-1又名CXCL12或前B細胞刺激因子，屬于CXC族趨化因子成員，CXCR-4屬于趨化因子家族， CXCR-4是SDF-1唯一的受體，是一個有7個跨膜結構域的G蛋白耦聯(lián)受體，在CD34+造血干/祖細胞表面及內皮祖細胞表面高表達[22]。SDF-1/CXCR-4軸參與造血干/祖細胞、T細胞等細胞的趨化和遷移過程,還在胚胎發(fā)育、維持造血系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)功能、介導免疫缺陷病毒感染等方面起重要作用。本研究結果顯示，藥物聯(lián)合EPCs輸注組的SDF-1表達高于單獨輸注EPCs組和BYHWD組。以上結果提示藥物聯(lián)合EPCs可能通過上調SDF-1的表達而促進EPCs遷移、歸巢，促進了損傷內皮的修復。而CXCR-4的表達出現了反向的趨勢，這可能與選擇的檢測標本為血管有關，由于SDF-1可在血管內膜表達，而CXCR-4僅在EPCs表面表達，當SDF-1與CXCR-4耦合整合入血管內膜完成修復過程，前者的大量表達勢必消耗大量的CXCR-4方能完成EPCs歸巢，因而出現了CXCR-4結果的負反饋這一推測還有待進一步的研究。

綜上所述，從血管形態(tài)學、血脂、血鈣和血管內皮功能檢測結果并結合交互作用分析可知，補陽還五湯聯(lián)合EPCs可以增加損傷血管內皮的修復作用，其機制可能與補陽還五湯通過改善局部微環(huán)境、促進了EPCs的歸巢有關。

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(責任編輯： 盧 萍， 余小慧)

BYHWD promotes endothelial progenitor cells to repair damaged vascular endothelium

ZHANG Wei1, HE Bing2, LI Liang3, LI Fei3, CAO Lang3, LIU Xiao-dan3, DENG Chang-qing3

(1TheAffiliatedYueyangHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Yueyang414000,China;2TheSecondAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410005,China;3InstituteofIntegratedChineseandWesternMedicineofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China.E-mail:zeen6463@sina.com)

AIM: To investigate the role of Buyanghuanwu decoction (BYHWD) in promoting endothelial progenitor cells (EPCs)-induced recovery of damaged vascular endothelium.METHODSThe endothelial damaged rats were lavaged with BYHWD and injected with EPCs through vena caudalis. The repaired situation of damaged endothelium was observed.RESULTSCompared with EPCs group and BYHWD group, the endothelial thickness was reduced, the levels of calcium, triglycerides and total cholesterol were decreased, but the high density lipoprotein levels were increased. In addition, the protein expression of vascular endothelial nitric oxide synthase and vascular stromal cell-drived factor-1 was sig-nificantly increased, but the expression of CXC chemokine receptor-4 was significantly reduced in BYHWD+EPC group.CONCLUSIONBYHWD promotes EPCs repairing damaged endothelium, the mechanism may be related to improve the internal environment and promotes the EPCs homing.

Buyanghuanwu decoction; Endothelial progenitor cells; Vascular endothelium; Endothelial nitric oxide synthase; Stromal cell-derived factor-1； CXC chemokine receptor-4

1000- 4718(2017)11- 1969- 06

2017- 04- 12

2017- 06- 07

國家自然科學基金資助項目(No. 81001494)；湖南省教育廳重點實驗室開放基金項目 (No. 15k059)；湖南省自然科學基金資助項目(No. 2016JJ4069)

△通訊作者 Tel: 13787177397; E-mail: zeen6463@sina.com

R363； R285.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.008