阿司匹林對同源不同輻射抗拒能力鼻咽癌細胞的凋亡誘導作用*

李安飛， 羅海丹， 陳 昱， 蘇箔金， 王冬輝， 楊惠玲

(中山大學中山醫學院病理生理教研室， 廣東 廣州 510080)

阿司匹林對同源不同輻射抗拒能力鼻咽癌細胞的凋亡誘導作用*

李安飛， 羅海丹， 陳 昱， 蘇箔金， 王冬輝， 楊惠玲△

(中山大學中山醫學院病理生理教研室， 廣東 廣州 510080)

目的探討阿司匹林誘導同源不同輻射抗拒能力鼻咽癌細胞株CNE2R/CNE2凋亡的作用及其機制。方法采用MTT 法、流式細胞術和Western blot法檢測并比較阿司匹林對CNE2R 和CNE2細胞活力、細胞凋亡及凋亡相關蛋白procaspase-3、cleaved caspase-3、procaspase-9、procaspase-12、PARP、cleaved PARP、Bcl-2和Bax，以及PI3K p110α、Akt和p27蛋白水平的影響。結果阿司匹林抑制同源不同輻射抗拒能力細胞CNE2R/CNE2的活力(阿司匹林對CNE2細胞作用24、48和72 h的IC50分別為6.18、3.92和3.06 mmol/L，對CNE2R細胞作用24、48和72 h的IC50分別為7.05、3.90和2.20 mmol/L，兩者差異無統計學顯著性)。阿司匹林作用48 h后，CNE2R細胞凋亡率升高，明顯高于CNE2細胞(P<0.05)。阿司匹林作用48 h后，CNE2和CNE2R細胞中procaspase-3、procaspase-9、procaspase-12和PARP的蛋白水平降低，cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平升高(P<0.05)；PI3K p110α和Akt蛋白水平下降，Bcl-2水平降低，Bax水平升高，Bcl-2/Bax比值降低，p27水平升高(P<0.05)。結論阿司匹林對同源不同輻射抗拒能力鼻咽癌細胞株CNE2R和CNE2具有同等細胞活力抑制作用；并且可以誘導細胞凋亡，且對抗輻射細胞株CNE2R的凋亡誘導作用更明顯。阿司匹林的抗癌作用可能與其影響PI3K/Akt信號通路及其下游蛋白的水平有關。

鼻咽癌； 輻射抗拒性； 阿司匹林； 細胞凋亡

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)高發于中國南方地區，具有明顯的地區性和家族聚集性。放療為鼻咽癌的首選療法，但放療耐受導致30%～40%病人發生局部復發和遠處轉移，使其成為提高鼻咽癌患者長期生存率的最大障礙[1]，因此尋找可抑制鼻咽癌細胞活性且逆轉輻射抗拒能力的藥物，是提高鼻咽癌病人預后的關鍵。阿司匹林(aspirin，ASA)作為經典的非甾體類抗炎藥，近年來在臨床研究和基礎研究中均發現其通過影響多種細胞內分子對結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸腫瘤等多種腫瘤發揮抗癌效應[2-5]。一項病例對照研究指出有規律地服用阿司匹林患者其鼻咽癌患病風險較低[6]，目前尚無針對阿司匹林對鼻咽癌抗癌效應及逆轉輻射抗拒能力的相關機制研究。本實驗擬采用MTT法、流式細胞術和Western blot法檢測并比較阿司匹林對本實驗室構建的同源不同輻射抗拒能力的鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞[7]的細胞活力、細胞凋亡和PI3K/Akt信號通路及其下游信號蛋白Bcl-2/Bax和p27的影響及差異，以探討阿司匹林對CNE2R/CNE2細胞的抑制作用及其機制，為鼻咽癌尤其是抗輻射鼻咽癌的治療提供新靶點和潛在抗癌制劑。

材 料 和 方 法

1材料、試劑和儀器

低分化鼻咽癌細胞株CNE2購自中山大學實驗動物中心；抗輻射鼻咽癌細胞株CNE2R為本實驗室構建。

阿司匹林、MTT和DMSO購自Sigma。RPMI-1640培養基購自Gibco；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche；鼠抗人procaspase-3、cleaved caspase-3、procaspase-9、procaspase-12、PARP、cleaved PARP、Bcl-2、Bax和p27單克隆抗體，兔抗人PI3K p110α、總Akt、Akt1和p-Akt單克隆抗體，HRP 標記的抗兔/鼠IgG均購自Cell Signaling Technologies；鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Sigma；鼠抗人β-tubulin單克隆抗體購自Merck。

SUNRISE全自動酶標儀購自Tecan；10色分析型流式細胞儀(Gallios)購自Becton Dickinson；分光光度計購自Thermo。

2主要方法

2.1細胞培養 CNE2和CNE2R細胞用含10%胎牛血清、青-鏈霉素的RPMI-1640 細胞培養基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，取對數生長期細胞進行實驗。

2.2MTT比色法檢測鼻咽癌細胞的活力 用胰酶(2.5 g/L)消化對數生長期細胞，接種于96 孔板(每孔為2×103)，每孔200 μL。貼壁12 h后，實驗組各孔分別加入含ASA的培養基200 μL(終濃度為1、2、4、8和16 mmol/L)，對照組加入含0.16%DMSO的培養基200 μL，空白組加入培養基200 μL，每組設8孔，重復3次。藥物作用24、48和72 h后，加入20 μL MTT (5 g/L)溶液，在37 ℃、5%CO2條件下孵育3.5 h。吸出各孔中液體，加入150 μL DMSO，振蕩5～10 min使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀波長為570 nm處測量各孔的吸光度(A)值。細胞生存率(%)=A處理組/(A處理組-A空白組)×100%。

2.3AnnexinⅤ/PI雙染色結合流式細胞術檢測鼻咽癌細胞的凋亡 接種細胞于6孔板(密度為每孔2×105)，分別以0、2.5和5 mmol/L阿司匹林作用48 h后，用無EDTA胰酶消化收集細胞，冰PBS洗2遍，離心棄上清，用AnnexinⅤ/PI雙染色標記法檢測細胞凋亡率。

2.4Western blot法檢測鼻咽癌細胞凋亡以及PI3K/Akt信號通路及其下游相關蛋白表達水平 細胞在濃度為0、1.25、2.5和5 mmol/L的阿司匹林作用48 h后，收集全蛋白細胞蛋白樣本，常規BCA方法蛋白定量。行10% SDS-PAGE，轉移到PVDF膜，室溫5%BSA封閉1 h，加入Ⅰ抗孵育4 ℃過夜，TBST洗膜3次，Ⅱ抗孵育60 min，TBST洗膜3次，ECL發光液顯色曝光，以β-actin或β-tubulin為內參照，Image Lab軟件分析結果。

3統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異(LSD)法，離散型數據組間比較采用2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1阿司匹林對鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞活力的影響

阿司匹林作用24、48 和72 h后，計算得到阿司匹林作用于CNE2細胞的IC50分別為6.32、3.43和2.67 mmol/L，作用于CNE2R細胞的IC50分別為7.15、5.00和2.20 mmol/L，阿司匹林對2種NPC細胞活力的影響差異無統計學顯著性，阿司匹林對不同輻射抗拒能力鼻咽癌細胞具有同等的細胞活力抑制作用，見圖1。

Figure 1. Effect of aspirin on viability of CNE2 (A) and CNE2R (B) cells for 24, 48 and 72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group.

圖1阿司匹林作用24、48和72h對鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞活力的影響

2阿司匹林對鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞凋亡率的影響

流式細胞術檢測結果示阿司匹林作用48 h對CNE2和CNE2R細胞具有劑量依賴性地誘導凋亡的作用，以晚期凋亡為主。高劑量組中，CNE2R細胞的晚期凋亡率為17.94%，明顯高于CNE2細胞的11.41%，差異有統計學意義(P<0.05)，說明阿司匹林可能具有潛在特異地誘導CNE2R 細胞凋亡的作用，見圖2。

Figure 2. The apoptosis of CNE2R and CNE2 cells after treatment with aspirin. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vsCNE2 cells.

圖2阿司匹林對鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞凋亡的誘導作用

3阿司匹林對鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞凋亡相關蛋白水平的影響

Western blot實驗檢測結果發現阿司匹林作用48 h后，CNE2和CNE2R細胞中procaspase-3、procaspase-9和procaspase-12的蛋白表達水平呈劑量依賴性降低，cleaved caspase-3的蛋白水平在低濃度阿司匹林(1.25 mmol/L)作用下無明顯變化，而在中、高劑量組(2.5和5 mmol/L)的蛋白水平明顯升高，且呈劑量依賴性；PARP蛋白水平在2株細胞中均呈劑量依賴性降低，在阿司匹林高濃度組(5 mmol/L)中cleaved-PARP的蛋白水平明顯升高，見圖3。

4阿司匹林對鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞PI3K-Akt信號通路及下游Bcl-2/Bax和p27蛋白水平的影響

Western blot實驗檢測結果發現阿司匹林作用48 h后，CNE2和CNE2R細胞中PI3K p110α、總Akt、Akt1和p-Akt的蛋白水平呈劑量依賴性降低，其中p-Akt下降水平在CNE2R細胞中更明顯，提示阿司匹林作用48 h后CNE2和CNE2R細胞中PI3K/Akt信號通路可能被抑制，見圖4。PI3K/Akt信號通路下游蛋白Bcl-2/Bax和p27的水平均受到不同程度的影響，阿司匹林作用48 h后，CNE2和CNE2R細胞中的Bcl-2蛋白呈濃度依賴性降低，而Bax則呈濃度依賴性升高，Bcl-2/Bax蛋白半定量比值呈濃度依賴性降低，且在CNE2R細胞中下降幅度更大(P<0.05)；阿司匹林作用48 h后，CNE2和CNE2R細胞中p27蛋白水平呈濃度依賴性升高，尤其是在高劑量處理組(5 mmol/L)其蛋白水平明顯高于空白對照組，見圖5。

Figure 3. The effects of aspirin on the expression levels of apoptosis-related proteins in the CNE2R and CNE2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group.

圖3阿司匹林對鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞凋亡相關蛋白水平的影響

Figure 4. The effects of aspirin on the protein levels of PI3K/Akt signaling-related molecules in the CNE2R and CNE2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group.

圖4阿司匹林對鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞PI3K/Akt信號通路蛋白水平的影響

討 論

1阿司匹林抑制鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞的細胞活力并誘導其凋亡

阿司匹林又名乙酰水楊酸，為非甾體類解熱鎮痛藥，其主要臨床應用為抗炎鎮痛和抗血栓。在過去的20余年里，大量的臨床病例研究結論指出服用阿司匹林可以降低腸癌、乳腺癌、前列腺癌中腺癌的發病風險[8]。隨著研究的深入，在部分鱗癌如皮膚癌[9]、頭頸部腫瘤[10-11]病例中也發現阿司匹林具有降低患癌風險；多項體外細胞以及體內動物研究證實阿司匹林具有廣泛的抗癌效應。而有關阿司匹林在鼻咽癌領域的應用僅有少量的臨床病例回顧性研究，均提示其可降低鼻咽癌的發病風險和死亡率[6]。

關于阿司匹林抗癌效應的機制研究，目前主要集中在其可直接或間接誘導腫瘤細胞凋亡、干擾腫瘤細胞能量代謝以及影響腫瘤細胞自噬從而影響腫瘤發生、發展以及轉移[2,12-13]。而有關阿司匹林對鼻咽癌細胞的抗癌作用機制及其是否具備逆轉輻射耐受尚未見相關研究報道。本研究首次在鼻咽癌同源不同輻射抗拒能力細胞株CNE2和CNE2R中揭示阿司匹林對鼻咽癌細胞的抗癌活性及機制及其較特異地誘導輻射耐受鼻咽癌細胞株CNE2R產生凋亡。在本研究中，阿司匹林作用于CNE2細胞24 h、48 h和72 h后的IC50分別為6.18、3.92和3.06 mmol/L，作用于CNE2R細胞24 h、48 h和72 h后的IC50分別為7.05、3.90和2.20 mmol/L，兩者之間的差異無統計學顯著性，因此可以認為阿司匹林對于輻射耐受鼻咽癌細胞與輻射敏感鼻咽癌細胞具有同等的細胞毒性。腫瘤細胞毒性涉及多方面因素，包括細胞凋亡、壞死、自噬及細胞生長抑制等；我們采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術進一步研究阿司匹林對鼻咽癌細胞CNE2和CNE2R細胞凋亡的誘導作用，結果顯示阿司匹林誘導輻射耐受鼻咽癌細胞CNE2R的凋亡比例較輻射敏感的CNE2細胞高，從誘導細胞凋亡的角度提示阿司匹林具有潛在可逆轉鼻咽癌輻射抗拒的特點。

Figure 5. The effects of aspirin on the protein levels of Bcl-2/Bax and p27 in the CNE2R and CNE2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group.

圖5阿司匹林對鼻咽癌CNE2R和CNE2細胞Bcl-2/Bax和p27蛋白水平的影響

2阿司匹林影響鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞的凋亡相關蛋白的水平

為闡明阿司匹林對鼻咽癌細胞CNE2和CNE2R的凋亡誘導作用，我們通過Western blot法檢測阿司匹林作用于2株細胞48 h后凋亡相關蛋白水平的變化，結果發現隨著阿司匹林濃度的增加，CNE2和CNE2R 細胞中procaspase-3、procaspase-9和procaspase-12的蛋白水平降低，而cleaved caspase-3隨著阿司匹林濃度的加大尤其是在中高劑量作用下蛋白水平明顯增高，說明阿司匹林可能通過激活caspase-9和caspase-12信號誘導鼻咽癌細胞CNE2和CNE2R發生凋亡；已有大量研究指出阿司匹林可引起腫瘤細胞發生多種途徑的細胞凋亡[14]。CNE2和CNE2R細胞經過阿司匹林處理后其PARP蛋白水平降低，cleaved-PARP的蛋白水平增加，進一步說明阿司匹林可以誘導鼻咽癌細胞CNE2和CNE2R發生凋亡。

3阿司匹林影響鼻咽癌CNE2R/CNE2細胞PI3K/Akt信號同類及其下游分子Bcl-2/Bax和p27蛋白的水平

為了進一步探究阿司匹林誘導鼻咽癌細胞CNE2和CNE2R凋亡的機制，我們采用Western blot法檢測PI3K/Akt信號通路及其下游相關蛋白的水平。結果顯示阿司匹林作用48 h后，隨著其劑量的增加， PI3K p110α的蛋白水平逐漸降低，總Akt、Akt1及p-Akt的水平均呈現劑量依賴性地降低，提示阿司匹林可能抑制鼻咽癌細胞CNE2和CNE2R的PI3K/Akt信號通路。PI3K/Akt信號通路的異?；罨捌湎掠畏肿赢惓５那闆r存在于多種腫瘤中[15]。PI3K p110α是PI3K蛋白重要的催化亞基，該催化亞基由PIK3CA基因編碼。以往研究發現該基因在多種腫瘤中存在突變，導致PI3K及其下游通路異?；罨痆16]。Zhang等[17]發現鼻咽癌組織中存在部分PIK3CA基因突變。Liao等[18]通過臨床病例研究發現，規律服用阿司匹林可提高PIK3CA基因突變腸癌患者的預后；同時體外研究發現阿司匹林具有抑制PI3K/Akt信號的作用[19]，因此我們認為阿司匹林對鼻咽癌細胞CNE2R/CNE2的凋亡誘導作用可能涉及對PI3K/Akt信號轉導通路的抑制。進一步通過Western blot法檢測該信號通路下游的Bcl-2/Bax和p27的蛋白水平，結果顯示阿司匹林作用48 h后，CNE2和CNE2R細胞內Bcl-2蛋白水平呈劑量依賴性降低；而Bax和p27則與之呈相反趨勢，通過蛋白半定量分析發現Bcl-2/Bax比值呈劑量依賴性降低，且在CNE2R細胞中幅度更大；Choi等[4]發現，Bcl-2是阿司匹林誘導乳腺癌細胞凋亡的靶點之一。我們認為阿司匹林誘導鼻咽癌CNE2和CNE2R發生凋亡而產生抗癌效應，該過程可能涉及抑制PI3K/Akt信號通路并影響其下游Bcl-2/Bax和p27蛋白的水平；并且具有潛在逆轉鼻咽癌輻射抗拒的特性。

綜上所述，本研究認為阿司匹林可抑制同源不同輻射抗拒能力的鼻咽癌CNE2R/CNE2 細胞的活力并誘導其發生細胞凋亡，從而產生抗癌效應。該過程可能涉及影響PI3K/Akt信號轉導通路及其下游Bcl-2/Bax和p27蛋白的水平。此外， Din等[20]指出，阿司匹林具有誘導結直腸癌細胞自噬水平升高的作用從而抑制結直腸癌，而針對鼻咽癌尚無相關研究報道，有待進一步探究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of aspirin on apoptosis of homologous nasopharyngeal carcinoma cells with different radioresistance

LI An-fei, LUO Hai-dan, CHEN Yu, SU Bo-jin, WANG Dong-hui, YANG Hui-ling

(1DepartmentofPathophysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:yanghl@mail.sysu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of aspirin on the apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE2R and CNE2 with different radioresistance and its potential mechanism.METHODSThe effects of aspirin on the cell viability, apoptosis, and protein levels of procaspase-3， cleaved caspase-3， procaspase-9， procaspase-12， PARP and cleaved PARP， PI3K p110α， Akt， Bcl-2， Bax and p27 in the CNE2R cells and CNE2 cells were detected by the methods of MTT assay, flow cytometry and Western blot.RESULTSAspirin inhibited the viability of homologous nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE2 and CNE2R (with the IC50to CNE2 cells of 6.18, 3.92 and 3.06 mmol/L for 24 h, 48 h and 72 h, respectively; and with the IC50to CNE2R cells of 7.05, 3.90 and 2.20 mmol /L for 24 h, 48 h and 72 h, respectively). After treated with aspirin for 48 h, the apoptotic rate of CNE2R cells was higher than that of CNE2 cells (P<0.05). After treated with aspirin for 48 h, the protein levels of procaspase-3, procaspase-9, procaspase-12 and PARP were decreased, the protein levels of cleaved caspase-3, cleaved PARP and p27 were increased, and the protein levels of PI3K p110α， Akt and Bcl-2/Bax were decreased.CONCLUSIONAspirin inhibits the viability of homologous nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE2R and CNE2 with different radioresistance. Aspirin also induces the apoptosis of CNE2 and CNE2R cells, which is more effective in CNE2R cells. The underlying mechanisms may be involved in affecting PI3K/Akt signaling pathway， Bcl-2/Bax and p27 expression.

Nasopharyngeal neoplasms; Radioresistance; Aspirin; Apoptosis

1000- 4718(2017)11- 1980- 07

2017- 04- 05

2017- 08- 01

國家自然科學基金資助項目(No.81372410)；廣東省科技計劃(No. 2013B031800002； No. 2015A020211006)

△通訊作者 Tel: 020-87332268； E-mail： yanghl@mail.sysu.edu.cn

R739.6； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.010