沉默Smo基因對人宮頸癌HeLa細胞活力及凋亡的影響*

宋 凌， 周 強， 李 娜， 余 潔， 李 陽， 張 翅

(1商丘醫學高等專科學校， 河南 商丘 476100； 2鄭州市兒童醫院， 河南 鄭州 450052)

沉默Smo基因對人宮頸癌HeLa細胞活力及凋亡的影響*

宋 凌1△， 周 強2， 李 娜1， 余 潔1， 李 陽1， 張 翅1

(1商丘醫學高等專科學校， 河南 商丘 476100；2鄭州市兒童醫院， 河南 鄭州 450052)

目的使用RNA干擾技術沉默Smoothened(Smo)基因，探討其對宮頸癌HeLa細胞活力和凋亡的影響。方法采用SmoshRNA轉染宮頸癌HeLa細胞；采用RT-PCR和Western blot技術檢測各組HeLa細胞Smo和轉錄因子Gli1的mRNA和蛋白表達；采用MTT比色法測定沉默Smo后細胞生長的情況；流式細胞術檢測SmoshRNA對細胞周期和凋亡的影響。結果與對照組比較，SmoshRNA轉染細胞72 h后，Smo和Gli1的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)。Smo基因沉默后，HeLa細胞的活力明顯降低，細胞明顯阻滯于G0/G1期，細胞凋亡率顯著升高。結論沉默Smo基因可有效抑制人宮頸癌HeLa細胞生長，并誘導其凋亡。

Smo基因； 宮頸癌； RNA干擾； 細胞凋亡

在世界范圍內，宮頸癌是婦女第二常見的惡性腫瘤，也是婦女發病和死亡的主要原因之一[1]。診斷為IIB期～IVA期宮頸癌患者的標準治療方法是基于順鉑的化療和放療， 然而，5年生存率只有66%[2]。目前對復發和轉移性疾病患者的治療方法仍有限，這些宮頸癌患者總生存期<12個月[3-5]。迄今為止，生物治療雖能夠有限地提高患者的生存率[6-7]，但是仍然需要尋找潛在的新靶點和新的治療策略。

Hedgehog (Hh)是高度保守的信號通路。它在人的胚胎發育、器官形成、組織分化以及組織修復中起重要作用。Smoothened(Smo)蛋白是Hh信號通路上的膜蛋白，也是Hh信號通路的轉化分子，它可以將細胞外的Sonic hedgehog(Shh)信號轉化成細胞內的Gli信號，觸發細胞內信號，激活轉錄因子Gli1，并能激活Shh信號通路[8-9]。當Smo基因過表達時，可異常激活Hedgehog通路，產生大量促癌因子[10]，使細胞發生轉化和惡變。許多研究發現，由Smo介導的Hh信號轉導途徑異常激活，與許多惡性腫瘤的發生和發展密切相關，例如黑素瘤、胰腺癌、胃癌、 前列腺癌、乳腺癌、結腸直腸癌和宮頸癌等[11]。本研究旨在利用SmoshRNA轉染人宮頸癌HeLa細胞，進一步探討Smo基因對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響，為宮頸癌基因治療提供理論依據。

材 料 和 方 法

1材料

HeLa細胞購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection， ATCC)；胎牛血清和RPMI-1640培養基購自Gibco；脂質體LipofectamineTM2000及TRIzol試劑盒購自Invitrogen；抗Smo、β-actin及Gli1 抗體購自Santa Cruz。陰性對照質粒(pRS-scrambled)和Smo干擾質粒(pRS-shSmo)購自OriGene；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自Invitrogen；MTT細胞毒性檢測試劑盒購自江蘇碧云天公司。

2方法

2.1細胞培養 將HeLa細胞于RPMI-1640培養液(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，37 ℃、5% CO2培養箱中貼壁培養。觀察細胞生長狀態，每2～3 d進行細胞換液，培養3～4 d后用胰酶消化，傳代培養。

2.2轉染重組質粒 將質粒pRS-scrambled和pRS-shSmo分別轉染HeLa細胞，轉染方法參照Lipofectamine 2000操作說明書進行。在6孔板中每孔加入3×108個細胞，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待次日細胞融合度達到50%左右時進行轉染。具體步驟如下：加入50 μL dH2O至含有表達質粒的試管中，渦旋試管混勻質粒，溶液濃度為100 mg/L。得到2組細胞：(1) 陰性對照(scrambled)組：轉染質粒pRS-scrambled的HeLa細胞；(2) 實驗(shSmo)組：轉染重組質粒pRS-shSmo的HeLa細胞；空白對照(blank control)組由等量培養基替代。

2.3MTT法檢測細胞活力 取對數期生長的細胞，每孔種(3～6)×103個細胞，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h。設置空白對照孔。分別轉染24 h、48 h和72 h。隨后加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養4 h后，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min 溶解結晶，酶標儀檢測492 nm波長吸光度(A)值。每組設 5 個復孔，實驗重復 3 次。計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。

2.4RT-PCR檢測細胞中Smo和Gil1的mRNA表達 收集經重組質粒轉染24 h、48 h和72 h的細胞，用Trizol提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書合成cDNA，用cDNA為模板進行PCR。Smo上游引物序列為5’-CGCTACCCTGCTGTTATTCTCT-3’，下游序列引物為5’-CAGGTGGAAGTAGGAGGTCTTG-3’，產物大小為306 bp；Gli1上游引物序列為5’-TTGGAGAAGCCGAGCCGAGTATC-3’, 下游序列引物為5’-GAGTACAGAGGTTGGGAGGTAAGG-3’，產物大小為201 bp[12]；GAPDH上游引物序列為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’， 下游序列引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’， 產物大小為226 bp。擴增條件為:95 ℃預變性30 s； 95 ℃變性30 s， 63 ℃退火45 s， 72 ℃延伸45 s，共30個循環； 72 ℃終止延伸5 min。 將 PCR 產物進行 1%瓊脂糖凝膠電泳。采用凝膠成像系統觀察結果。運用ImageJ軟件測定各條帶灰度值。

2.5細胞中Smo和Gli1蛋白的Western blot法檢測 重組質粒轉染24 h、48 h和72 h后，裂解細胞提取總蛋白，BCA法定量，進行SDS-PAGE并轉移至PVDF膜。封閉液封閉1 h，加入稀釋過的 I 抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜 3 次，加入稀釋過的 II 抗，室溫下孵育 1 h，TBST洗膜 3 次，加入ECL 進行發光反應，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印跡。運用ImageJ軟件測定各條帶灰度值。

2.6細胞凋亡檢測 收集shSmo轉染 72 h 組、scrambled組和未轉染對照組細胞。PBS洗滌3遍，用100 μL預冷的Binding Baffer重懸細胞，加入5 μL FITC 標記的Annexin V 和 5 μL PI 混勻避光孵育15 min，再加入400 μL 緩沖液混勻，上流式細胞儀檢測。

2.7細胞周期檢測 收集shSmo轉染 72 h 組、scrambled組、未轉染對照組細胞。PBS洗滌3遍，加入1 mL 70%的冰乙醇，4 ℃孵育過夜，離心去除乙醇，PBS洗滌2遍，加入1 mL PI (50 mg/L)溶液，4 ℃避光30 min，上流式細胞儀檢測。

3統計學處理

采用GraphPad Prism 5.0進行統計學分析。實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組平均數之間比較采用單因素方差分析檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1SmoshRNA抑制HeLa細胞的活力

MTT法觀察HeLa細胞轉染24、48和72 h后的細胞活力，發現轉染過的細胞生長緩慢。結果顯示實驗組的細胞抑制率明顯高于陰性對照組和空白對照組(P<0.01)；陰性對照組和空白對照組細胞抑制率無明顯差異，SmoshRNA可有效地抑制HeLa細胞的活力，轉染72 h的抑制效果最顯著，各組細胞生長抑制率見圖1。

Figure 1. The effect ofSmogene silencing on the cell activity of human cervical cancer HeLa cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshSmo group.

圖1MTT法檢測沉默Smo基因對HeLa細胞活力的影響

2Smo和Gli1在HeLa細胞中的mRNA水平

在HeLa細胞中檢測沉默Smo基因后Smo 和Gli1的mRNA表達情況。RT-PCR實驗結果顯示轉染48 h和72 h后細胞Smo和Gli1的mRNA水平低于陰性對照組及空白對照組(P<0.05)，見圖2。

3Smo和Gli1蛋白在HeLa細胞中的表達

Western blot實驗結果顯示，轉染48 h和72 h后細胞Smo和Gli1蛋白的表達水平較空白對照組和陰性對照組明顯降低(P<0.05)，見圖3。Western blot實驗結果與RT-PCR結果一致。

Figure 2. The mRNA expression of Smo and Gli1 in human cervical cancer HeLa cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsscrambled group.

圖2轉染HeLa細胞后Smo和Gli1的mRNA表達

Figure 3. The protein expression of Smo and Gli1 in human cervical cancer HeLa cells after transfection was analyzed by Western blot. Each lane contains 30 μg protein extract from the cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsscrambled group.

圖3轉染后HeLa細胞Smo和Gli1蛋白的表達

4沉默Smo基因對HeLa細胞周期的影響

流式細胞術結果顯示，轉染72 h后shSmo組的G0/G1期細胞比例顯著高于scrambled組(P<0.05),S期和G2/M期的細胞比例，均顯著低于scrambled組(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The effect ofSmogene silencing on cell cycle of HeLa cells analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsscrambled group.

圖4流式細胞術檢測沉默Smo基因對HeLa細胞周期的影響

5沉默Smo基因對HeLa細胞凋亡的影響

流式細胞術分析結果顯示，HeLa細胞轉染SmoshRNA 72 h 后凋亡率為20.31%，顯著高于scrambled組(P<0.01)。證實轉染SmoshRNA 72 h可以促進HeLa細胞凋亡，見圖5。

Figure 5. The effect ofSmogene silencing on the apoptosis of HeLa cells analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscrambled group.

圖5流式細胞術檢測沉默Smo基因對HeLa細胞凋亡的影響

討 論

腫瘤的發生發展是多因素作用、多基因參與和多階段調控的過程，同時也是細胞增殖分化與細胞凋亡平衡失調的過程。癌基因的激活或者抑癌基因的失活以及其它相關調節基因的突變均在蛋白水平上起作用。Hedgehog信號通路是人類胚胎發育過程中調控細胞增殖和組織分化的重要信號通路，近來研究發現Hedgehog信號通路在腫瘤的發生過程中同樣發揮著重要作用[13]。Smo蛋白是由1 024個氨基酸組成，起著G蛋白偶聯受體的作用[14]。Smo蛋白具有1個細胞內羧基末端結構域、1個細胞外氨基末端結構域和7個疏水跨膜結構域[15-16]。當沒有Hh蛋白時，受體蛋白Ptch抑制Smo蛋白的活性，從而阻斷Hh信號通路；當有Hh蛋白時，Hh與Ptch蛋白結合，除去Smo蛋白的抑制，甚至激活的Smo蛋白可以將細胞外Hh信號轉化成細胞內Gli信號，然后激活Hh相關蛋白的表達，包括Hhip、Ptch、Gli1、cyclin D、Myc、Bmi1、Bcl-2和VEGF等[17]。 Hh信號轉導途徑近年來在惡性腫瘤的基因治療研究中得到關注。相關研究結果表明，采用siRNA抑制胃癌MGC803細胞、乳腺癌MCF-7細胞、肝癌Huh-7細胞和胰腺癌PANC-1細胞的Smo和Gli1表達，可抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡[18-19]，并提高細胞對化療藥物的敏感性，因此Smo可能是腫瘤基因治療的有效靶點[20-21]。

本研究中我們發現SmoshRNA作用于人宮頸癌HeLa細胞可降低其下游轉錄因子Gli1的蛋白和mRNA表達水平。SmoshRNA可有效抑制HeLa細胞的活力并誘導其凋亡。研究發現，在Sonic hedgehog信號通路中，Smo蛋白作為激動因子激活Gli1蛋白，Gli1蛋白作為轉錄因子啟動下游相關基因，共同促進該通路的活化。通過對這2種蛋白相關性的研究發現Smo蛋白和Gli1蛋白表達呈正相關，推測癌癥發生過程中的Sonic hedgehog信號通路異常激活可能是通過Smo蛋白高表達上調下游轉錄因子Gli1蛋白的表達參與癌癥發生的[16]。目前關于在宮頸癌中Smo蛋白和Gli1蛋白表達之間是否存在調節機制尚未見文獻報道，因此我們在研究Smo的同時檢測了Gli1蛋白在宮頸癌HeLa細胞中的表達情況。實驗結果顯示，運用Smo特異性shRNA轉染宮頸癌HeLa細胞能有效降低Smo的表達，同時Gli1的表達也隨之降低，提示Smo可能通過Sonic hedgehog信號通路調控Gli1的表達。Smo在宮頸癌細胞的生長和凋亡中起重要作用，檢測Smo和Gli1蛋白表達可能為臨床診斷和治療宮頸癌提供參考依據。目前針對Hh信號通路在腫瘤發生發展中作用的研究還很局限，下一步我們將將針對Hh在腫瘤侵襲和轉移中的功能以及與其它信號通路如Notch、WNT和TGF-β等的聯系方面做進一步研究[22]。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effects of Smo gene silencing on cell activity and apoptosis of human cervical carcinoma HeLa cells

SONG Ling1, ZHOU Qiang2, LI Na1, YU Jie1, LI Yang1， ZHANG Chi1

(1ShangqiuMedicalCollege,Shangqiu476100,China;2ZhengzhouChildren’sHospital,Zhengzhou450052,China.E-mail: 13937095548@163.com)

AIM: To investigate the effect of Hedgehog (Hh) signaling pathway on the viability and apoptosis of cervical carcinoma cells by shRNA technique to knock downSmoothened(Smo) gene.METHODSSmoshRNA was used to transfect the cervical carcinoma HeLa cells. The expression of Smo and Gli1 at mRNA and protein levels in the HeLa cells was determined by RT-PCR and Western blot， respectively. The effect ofSmogene silencing on the growth of the cells was measured by MTT assay. The apoptosis and cell cycle were determined by flow cytometry.RESULTSCompared with control group, the mRNA and protein expression of Smo and Gli1 were evenly reduced obviously after transfected withSmoshRNA for 72 h (P<0.05). The viability of HeLa cells transfected withSmoshRNA was significantly inhibited. The percentages of the cells in G0/G1phase and early apoptosis rate were obviously higher inSmoshRNA transfection group than those in control group.CONCLUSIONSmogene silencing effectively inhibits the cell growth and induces the apoptosis of human cervical carcinoma cells.

Smogene; Cervical carcinoma; RNA interference; Apoptosis

1000- 4718(2017)11- 2015- 05

2017- 05- 02

2017- 07- 17

商丘市科技發展計劃(No. 143008)

△通訊作者 Tel: 0370-3251978; E-mail: 13937095548@163.com

R737.9； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.015