浙東白鵝骨骼肌發育相關因子MRFs，Pax3和Pax7基因的表達規律

王吟方亭， 任 婷， 朱松會， 梁世日， 何 珂， 趙阿勇

（1.浙江農林大學 動物遺傳育種與繁殖實驗室，浙江 杭州311300；2.浙江農林大學 動物科學與技術學院，浙江 杭州311300）

浙東白鵝骨骼肌發育相關因子MRFs，Pax3和Pax7基因的表達規律

王吟方亭1,2， 任 婷1,2， 朱松會1,2， 梁世日1,2， 何 珂1,2， 趙阿勇1,2

（1.浙江農林大學 動物遺傳育種與繁殖實驗室，浙江 杭州311300；2.浙江農林大學 動物科學與技術學院，浙江 杭州311300）

生肌調節因子家族（myogenic regulatory factors，MRFs）在胚胎期和出殼早期的骨骼肌分化過程中發揮重要作用；PAX家族中的2個轉錄因子Pax3和Pax7，被認為在肌纖維的生長發育過程中，指導眾多過程的形成。在鵝胚胎發育過程中這些基因的表達變化規律及在肌肉發育過程中的表達變化規律研究甚少。以浙東白鵝Anser cygnoides domestica ‘Zhedong’為研究對象，提取RNA合成cDNA并采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）研究MRFs,Pax3和Pax7在鵝胚胎期（7，11，15，19，23，27 d胚齡）及出生早期（出雛后7日齡）的表達規律，并分析其表達與胸、腿肌發育的相關性。結果顯示：MRFs，Pax3和Pax7基因均和鵝骨骼肌的發育相關，并且存在不同的表達規律。MRFs和Pax7基因在11～15 d胚齡期間出現表達高峰期，而Pax3基因在7 d胚齡即出現高表達，隨后表達下降。通過分析表明：這些基因的表達規律均和它們在肌肉發育過程中的作用密切吻合。圖2表1參25

動物學；鵝；骨骼肌發育；MRFs；Pax3；Pax7

骨骼肌組織的發生和發育是肉品質形成的重要因素。肌肉生成是一個復雜的程序，包括肌肉先祖細胞的增殖和遷移（或衛星細胞的激活），成肌細胞的生成、增殖和分化，成肌細胞的融合以及多核肌纖維的形成等過程。骨骼肌的先祖細胞在基因調控下遷移入肢芽間充質，分裂形成肌肉的始祖細胞庫，在基因調控下形成成肌細胞進入分化。成肌細胞在基因的調控下分泌特異因子，導致成肌細胞發生融合形成多核肌管。肌小管是初級肌肉纖維的前體細胞，隨后形成肌纖維，最后構成復雜的骨骼肌［1-2］。在胚胎發育后期階段，肌肉進入后期增長，主要包括肌纖維長度的增加和直徑的增大［3］。肌肉重生和自我更新來源于骨骼肌中的正常沉默的衛星細胞［4］。在這些過程中，多個調控因子進行雙向調節。目前，已確定與肌纖維生長發育相關的基因有MRFs（myogenic regulatory factors）基因家族、PAX（paired box）基因家族和肌肉生成抑制因子基因（Myostatin，MSTN）［5］等，MRFs家族包括肌分化因子MyoD，肌細胞生成素MyoG（Myogenin），生肌決定因子Myf6和Myf5［6］。它們調控前體肌細胞定型、細胞增殖和肌纖維的形成以及機體出生以后肌肉成熟和功能完備等肌肉發生和發育的各個環節［7-9］，對肌細胞的增殖和分化、肌纖維的數量和大小起著關鍵的調控作用，若該基因家族表達沉默則會導致生肌節形成的失敗，最終無法形成肌肉［10］。而PAX家族蛋白為一類重要的轉錄調控因子，在胚胎發育過程中對組織和器官的分化起重要的調控作用。其中，Pax3和Pax7等2個轉錄因子通過調控MRFs基因家族和其他相關基因，被認為在肌纖維的生長發育過程中，指導眾多過程的形成［11］。鵝Anser cygnoides是鳥綱雁形目Anseriformes鴨科Anatidae的一種動物。鵝肉是理想的高蛋白、低脂肪、低膽固醇的營養健康食品。因此，目前對鵝肉的需求量也日趨上漲，鵝肌肉生長和肉質形成的研究受到一定的關注。如前所述，MRFs基因家族和PAX基因家族參與肌肉的發育過程，與肌纖維的數量和大小有著密切關系。但鵝該基因家族在胚胎期肌肉發育過程中的表達規律及在肌肉發育過程中的調控作用未見報道。中國鵝品種資源非常豐富，記載于《中國禽類遺傳資源》上的地方品種共36個，培育鵝種5個。本研究以浙東白鵝Anser cygnoides domestica ‘Zhedong’為材料，該品種分布于浙江東部地區，為中等體型白色鵝種，其身軀有2種，分別是長方形和長尖形，全身羽毛白色，額部有肉瘤，頸部細長腿部粗壯，是中國肉鵝的著名地方品種，可作為研究肌肉生長發育的理想動物模型。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析技術，研究物種胚胎期和胚胎后早期胸肌（breast muscle,BM），腿肌（leg muscle,LM）中MRFs家族以及Pax3和Pax7的表達規律，以探索這些基因在肌肉發育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

試驗所用鵝個體由浙江天鴻鵝業提供（浙江紹興），選取相同批次且孵化條件相同的胚齡分別為7，11，15，19，23，27 d的鵝胚各3枚（分別以E7，E11，E15，E19，E23，E27表示）；同時選取同一批次出殼，并在相同飼養管理條件下飼養的7日齡鵝3只（以P7表示）。迅速分離出鵝胚以及出生后小鵝的胸肌和腿肌組織，置于液氮速凍，然后轉入-80℃冰箱保存。

1.2 總RNA提取和cDNA的合成

肌肉總RNA采用RNAiso plus（TaKaRa，大連）提取，RNA樣品經質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，紫外分光光度計檢測計算濃度。采用PrimeScriptTMreagent Kit（TaKaRa，大連）合成cDNA。

1.3 qRT-PCR及分析

根據已發表的鴨Anas platyrhynchos和鵝MRFs家族、Pax3和Pax7序列分別設計qRT-PCR引物（表1），GAPDH作為內參基因。引物由上海英駿生物工程有限公司合成。qRT-PCR采用SYB RPrime-ScriptRT-PCR Kit（TaKaRa，大連），反應體系和反應條件按試劑盒說明進行，設置技術平行的3個·樣品-1。采用CT值（循環數）比較法計算表達量，采用SASS分析表達差異是否顯著。

表1 研究采用的qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 胸肌和腿肌組織中生肌調節因子家族的表達變化

在胸肌和腿肌組織發育的不同階段均能檢測到MyoD（圖1A），Myf5（圖1B），MyoG（圖1C）和Myf6（圖1D）的表達，兩者表達模式相似，前3種基因均呈現反 “√”的模式，而Myf6的表達則均呈“wave” 模式。

MyoD：腿肌（LM）在E11～E23階段維持高表達，顯著高于其他階段（P＜0.05），在E15表達量達到最高；胸肌（BM）則在E15～E23階段維持高表達，顯著高于其他階段（P＜0.05），同樣在E15表達量達到最高。

Myf5：腿肌在E11表達量顯著上升（P＜0.05），達到最高，E15～E19階段維持高表達，E19～E23后顯著下降（P＜0.05），但在E23～E27表達量略微回升，出殼后表達量低。胸肌同樣在E11表達量顯著上升（P＜0.05），達到最高，E15～E19階段維持高表達，在E19～P7階段表達量逐漸降低。

Myf6：E7～E15表達量逐漸上升，E15～P7表達量逐漸下降。腿肌第15胚齡日表達量顯著高于其他胚齡日（P＜0.05），胸肌中E15表達量顯著高于其他階段（P＜0.05），出殼后表達量降低。

Myf6：腿肌在E7～E19階段表達量呈上升趨勢（E15和E11比較有小回落），在E23顯著下降（P＜0.05），而在E27～P7又顯著上升（P＜0.05）。胸肌的表達模式類似，E7～E15階段表達量呈上升趨勢，在E15達到表達最高峰，E15～E23顯著下降（P＜0.05），而E27～P7有所上升。該基因在胸肌中早于腿肌達到表達高峰期，并且P7階段達到第2高峰階段時，腿肌的表達顯著高于胸肌（P＜0.05）。

2.2 胸肌和腿肌組織中Pax家族基因表達變化

在胸肌和腿肌組織發育的不同階段均可檢測到Pax3的表達（圖2A），其表達呈逐漸降低模式，在胸肌和腿肌的表達模式相似。在胸肌和腿肌中，均在E7檢測到表達量最高，隨著生長發育，該基因的表達逐漸降低，在E15～E19階段，該基因的表達已顯著低于E7（腿肌在E15后表達顯著低于E7，P＜0.05；胸肌在E19后表達顯著低于E7，P＜0.05），E23后該基因表達量持續在較低水平。

在胸肌和腿肌組織發育的不同階段均可檢測到Pax7的表達（圖2B），在2個肌肉組織中的表達模式形似，均呈反 “√”型。在腿肌中Pax7基因在E11出現上升，并于E15達到表達最高時期，顯著高于其他階段（P＜0.05），在E15之后，基因表達保持較低水平。在胸肌中，該基因同樣在E15出現表達高峰后，保持在較低的表達水平，胸肌中該基因的表達整體低于腿肌。

圖1 鵝胸肌和腿肌不同發育階段生肌調節因子家族基因表達情況Figure 1 Expression profile of MRFs gene in breast muscle and leg muscle

圖2 鵝胸肌和腿肌不同發育階段Pax家族基因表達情況Figure 2 Expression profile of Pax gene in breast muscle and leg muscle

3 討論

3.1 MRFs家族對于鵝胚胎期及出生早期胸肌腿肌生長發育的作用

MRFs家族成肌因子均屬于堿性螺旋-環-螺旋（bHLH）轉錄因子，轉移非分化的細胞進入生肌系統，通過與參與骨骼肌分化的E12，E47，HEB等E蛋白形成異源二聚體識別DNA序列，從而激活肌酸激酶、肌球蛋白等與肌肉生成相關的特異性基因［13-15］。在肌肉生成過程中，MRFs家族并不同時表達，其成員在功能上表現出特有的表達模式。初級肌肉發育階段，涉及到了成肌前體細胞的命運決定和成肌細胞的大量增殖。該過程與MyoD和Myf5的作用有關。在次級肌肉發育過程中涉及到了成肌細胞融合為肌管和肌管進一步分化為肌纖維的過程，該過程中MyoG和Myf6扮演了重要的角色。有研究認為：在Pax3基因調控肌源性祖細胞遷移到目標位置后，Myf5率先開始表達，調節體節在軸下部位和肢芽中分化、增殖；接著MyoD在Myf5和Pax3的協調下被刺激表達，使成肌細胞退出細胞周期；MyoG同樣也在早期激活，作為肌肉分化因子調控肌肉進入分化形成階段；Myf6最終表達，并且在出生后成為主要轉錄產物，促使肌小管的形成［16-20］。

本研究發現：鵝胚胎期MRFs家族基因表達為（1）Myf5基因在胸肌和腿肌中有相似的表達規律，為先上升后下降的模式，并且其在胸肌和腿肌中均在E11到達表達的最高峰，并維持4～7 d，但也有不同之處，腿肌中發育的后期階段Myf5的表達略有回升，然而胸肌中Myf5呈現出持續下降的模式。一些研究認為，不同肌纖維類型的肌組織中，Myf5的表達模式有所差異。這是由于胸肌和腿肌在胚胎早期發生的起源中存在一定差異，胸肌主要起源于軸下生肌節的成肌細胞，腿肌雖然也主要起源于軸下生肌節，但是主要來源于遷移到肢芽處的成肌細胞［21］。高郵鴨Anas platyrhynchos ‘Gaoyou Breed’和金定鴨Anas platyrhynchos domestica‘Jinding’的相關研究中也表明：Myf5在胚胎發育早期出現高表達［21］。（2）MyoD在鵝胸肌腿肌中的表達規律跟Myf5極為相似，也是先升高后降低的趨勢，但也存在明顯的不同。MyoD在胸肌和腿肌中均在E15到達表達的最高峰，比Myf5到達最高峰的時間晚。該結果說明，雖然MyoD和Myf5均在肌肉發育的初級階段發揮作用，但還是存在不同的作用模式。朱文奇等［22］研究發現：在鴨中MyoD基因在E13～E21維持高表達，這和我們的研究結果基本保持一致的。（3）Myf6基因在E15（甚至腿肌E19）中出現表達高峰，并且在出殼后也出現較高的表達，這和朱文奇［22］報道的Myf6在E21出現表達高峰保持一致，該現象和Myf6基因參與肌小管的形成有關。MyoG和Myf6基因在成肌細胞的融合和分化中起作用,但是其表達規律不盡相同，這說明MyoG和Myf6有不同的功能。MyoG和Myf6在表達規律與它們的功能密切相關。

3.2 Pax3和Pax7基因對于鵝胚胎期及出生早期胸肌腿肌生長發育的作用

對于Pax3，首先，非分化的前體細胞轉化成肌細胞過程中，受到Pax3和Foxc2的互惠調控。其次，在肌肉肌細胞形成過程中，Pax3通過控制Myf5基因的增強子區域，從而控制MRFs基因家族的轉錄，調節細胞分化進入成肌細胞和肌絲層［23-24］。該現象表明：Pax3基因在胚胎發育早期就開始發揮作用。研究顯示，鴨在胚胎早期，Pax3基因表達最強，隨著時間增加而遞減。本研究中無論在胸肌還是在腿肌中，Pax3均是在E7表達量最高，隨著肌肉的生長發育，該基因的表達逐漸降低，這與已有的研究結果保持一致。

Pax7被認為是出生后肌肉發育即損傷肌肉修復過程中的標志基因。該基因通過與細胞生長、黏連等相關的特定基因結合來促進細胞增殖，抑制其分化［25］。在胚胎期，肌衛星細胞增殖并融合到已存在的肌管中，促進出生后肌纖維的增長。本研究中發現在鵝胸肌和腿肌發育過程中，該基因表達高峰期出現在E11～E15階段。可以認為，Pax7在調控肌祖細胞進入骨骼肌發生的過程中具有重要的作用。

本研究通過qRT-PCR研究了MRFs，Pax3和Pax7在鵝骨骼肌胚胎期以及出生早期的表達規律，發現這些基因均與鳥類的骨骼肌生成密切相關，并且總體上胸肌發育晚于腿肌，這可能與鳥類腿肌的特殊性有關，也和陳禧［12］的報道相一致。肌肉生成是一個復雜的程序，在胚胎期包括肌母細胞的增殖、退出細胞周期、最終分化導致生成多核肌纖維等步驟。本研究的結果，有助于更加具體和深入地了解鵝胚胎期肌肉發育相關基因的表達規律，為鵝骨骼肌發育過程中的調控機理提供理論依據。

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Expression patterns of MRFs,Pax3,and Pax7 during skeletal muscle development in Zhedong white geese

WANG Yinfangting1,2,REN Ting1,2,ZHU Songhui1,2,LIANG Shiri1,2,HE Ke1,2,ZHAO Ayong1,2
（1.Genetics,Breeding＆ Reproduction Laboratory of Animals,Zhejiang A ＆ F University,Hangzhou 311300,Zhejiang,China;2.College of Animal Science and Technology,Zhejiang A ＆ F University,Hangzhou 311300,Zhejiang,China）

The family of myogenic regulatory factors （MRFs） played an important role in the process of skeletal muscle differentiation during the embryonic stage and the early stage of hatching with Pax3 and Pax7,two transcription factors of the PAX family,guiding the formation of various processes during the growth and development of muscle fiber.To determine the expression profiles of these genes during the embryonic and muscle development stages in geese,the expression pattern of MRFs,Pax3,and Pax7 during the embryonic period（7th,11th,15th,19th,23th,27th day in embryonic （E）age）and early birth （7-day-age） in Zhedong White Geese was studied.Analysis included extracting RNA and synthetic DNA along with real-time PCR followed by further analysis on their relationship with the development of breast and leg muscles.We took three samples for tissue of each period,and the significance of expression was analyzed with SASS.Results revealed that MRFs,Pax3,and Pax7,were all related to the development of skeletal muscles in geese with different expression patterns.MRFs and Pax7 showed peak expression during the period from E11 to E15,and the highest expression of Pax3 with a declining expression appeared at E7.Findings suggested that the expression patterns of these genes were highly matched with their function during muscle development and provided a theoretical basis forfurther investigation of the regulatory mechanism of MRFs,Pax3,and Pax7 during skeletal muscle development in geese. ［Ch,2 fig.1 tab.25 ref.］

zoology;goose;skeletal muscle development;myogenic regulatory factors （MRFs）;Pax3;Pax7

S834

A

2095-0756（2017）06-1065-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.06.014

2016-12-13；

2017-03-02

國家自然科學基金資助項目（31372349）；浙江省自然科學基金資助項目（LQ14C030002）

王吟方亭，從事動物遺傳育種研究。E-mail:andy_wangyin@163.com。通信作者：趙阿勇，教授，博士，從事動物數量遺傳與分子遺傳育種研究。E-mail:zay503@zafu.edu.cn