孟魯司特鈉對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠NF-κB、TNF-α mRNA表達的影響

胡建英 王雅敏 李嶠坷

(武警四川總隊醫院呼吸科，四川 成都 614000)

孟魯司特鈉對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠NF-κB、TNF-α mRNA表達的影響

胡建英 王雅敏 李嶠坷1

(武警四川總隊醫院呼吸科，四川 成都 614000)

目的探討孟魯司特鈉對慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠核因子(NF)-κB、腫瘤壞死因子-α信使核糖核酸(TNF-α mRNA)表達的影響。方法選購清潔級SD成年雄性大鼠24只，以薰香煙法和氣管注入脂多糖建立COPD大鼠模型，按隨機數字表法分為模型組和用藥組各12只。模型組給予10 ml/kg生理鹽水灌胃，1次/d；用藥組給予0.2 ml孟魯司特鈉灌胃，1次/d，兩組均連續灌胃4 w。末次給藥結束，檢測兩組支氣管肺泡灌洗液白細胞總數和中性粒細胞(PMN)、單核巨噬細胞(AM)絕對計數及NF-κB、TNF-α、TNF-α mRNA表達情況。結果與模型組相比，用藥組白細胞總數、PMN、AM計數較低(Plt;0.05)；模型組與用藥組TNF-α表達強度分別為(3.30±0.51)、(2.70±0.67)，NF-κB表達強度分別為(2.90±0.61)、(2.30±0.71)，差異有統計學意義(Plt;0.05)；用藥組TNF-α mRNA表達(0.50±0.07)低于模型組(0.63±0.09)(Plt;0.05)。結論孟魯司特鈉治療COPD模型大鼠，能抑制NF-κB、TNF-α活性和TNF-α mRNA表達，孟魯司特鈉對COPD具有一定的療效。

慢性阻塞性肺疾病；孟魯司特鈉；腫瘤壞死因子-α mRNA；核因子-κB

目前尚不十分明確慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發病機制，其以肺血管、肺實質、氣道的慢性炎癥為特征，肺泡巨噬細胞、中性粒細胞增加，造成炎癥細胞激活而釋放多種細胞因子和介質，促進中性粒細胞炎癥反應和破壞肺結構〔1〕。有害氣體或顆粒、煙霧等均會造成肺部抗氧化、氧化及抗蛋白酶、蛋白酶的失衡，吸煙能誘導炎癥，造成肺臟損傷，吸入有害氣體或顆粒會引起肺部炎癥，與COPD的發病有密切聯系〔2〕。孟魯司特鈉為白三烯受體拮抗劑，能避免白三烯和受體相結合，能緩解氣道痙攣，抑制氣道炎癥，減輕氣道阻塞，降低氣道高反應性；能促進淋巴細胞凋亡，對氣道淋巴細胞核因子(NF)-κB的激活起到抑制作用〔3〕。本研究探討孟魯司特鈉對COPD模型大鼠NF-κB、腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗器材 上海精益醫用器材廠提供的血球計數板；購自香港華粵企業公司的UNIVERSAL 16R低溫離心機；Olympus顯微鏡；鄭大二附院氣管鏡室提供的灌肺氣管插管針。

1.2實驗藥品、試劑 北京中杉金橋公司的鼠抗NF-κB克隆抗體；武漢博士德生物工程有限公司的兔抗鼠TNF-α多克隆抗體；瑞氏(Wright)染液；Solarbio 公司的磷酸鹽緩沖液；沙河牌香煙購自鄭州卷煙廠，煙堿量為12 mg，焦油量為15 mg；脂多糖購：美國Sigma公司，貨號：Sigma-L2880，規格：10 mg，純度：≥99%；孟魯司特鈉購自魯南貝特制藥有限公司，國藥準字H20083330，規格：5 mg，純度：99%。

1.3實驗動物 選取清潔級SD成年雄性大鼠24只，12周齡，體重210～250 g，平均(230.21±13.75)g，合格證號SCXK(京)2009-0007，均購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養于溫度為19℃～25℃、濕度為55%～65%的環境下，每日光照10～12 h，噪音lt;60 dB，每周進行2次清洗消毒鼠籠，自由飲食、飲水，適應性喂養1 w后開始實驗。本實驗已通過動物研究委員會同意。

1.4分組和制備模型 采用隨機數字表法將常規喂養1 w的24只大鼠分為模型組和用藥組各12只。在實驗第1天和第15天將200 μg脂多糖向大鼠器官內緩慢注入，實驗第2～14天和第16～32天分別將大鼠置于自制的600 cm×30 cm×40 cm的煙熏箱中進行被動吸煙，2次/d，10支/次，60 min/次，兩次之間需間隔≥2 h。被動吸煙完成后，將大鼠放回原飼養籠中飼養，待大鼠出現活動明顯減少、偶有咳嗽、食欲下降、喘息等癥狀時，即造模成功。

1.5給藥方法 模型組大鼠在造模后每日接受10 ml/kg生理鹽水灌胃，1次/d，不給予其他任何處理。在25 ml注射用生理鹽水中加入1 g孟魯司特鈉中進行稀釋，備用。用藥組大鼠在造模后每日給予0.2 ml(6 mg/kg)孟魯司特鈉灌胃，1次/d，兩組均連續灌胃4 w。

1.6檢測方法

1.6.1支氣管肺泡灌洗液的制備 所有動物在最后一次用藥后48 h內進行頸椎脫臼法處死，分離氣管，將右肺支氣管結扎，以“T”形切口將氣管插管插入左肺支氣管，并將3 ml生理鹽水經氣管插管緩慢注入，保留3 min后將其吸出，以單層紗布過濾，反復4次，回收支氣管肺泡灌洗液。

1.6.2細胞計數及分類 擦拭干凈血球計數板，將蓋玻片蓋上，用毛細血管吸取制備的支氣管肺泡灌洗液，經上側面加入血球計數板，放入顯微鏡下，計數全部細胞。計數的全部×2×1/4×10 000=細胞數；細胞數×支氣管肺泡灌洗液毫升數=支氣管肺泡灌洗液中的細胞總數。取支氣管肺泡灌洗液12 ml，4℃ 2 000 r/min離心8 min，取適量沉渣涂片。以瑞氏染色法染色：在灌洗液涂片區滴滿染液，2 min后滴加pH6.4磷酸鹽緩沖液，切勿溢出染色區，染色5～10 min后，將染液以流水沖洗掉，將玻片晾干。鏡檢300個細胞分類計數，計算中粒細胞和巨噬細胞所占百分比，在計算出某種細胞在支氣管肺泡灌洗液中的總數。

1.6.3肺組織標本制作 將左主支氣管夾閉，在右主支氣管內固定硅膠管，在右肺內注入10%甲醛，至其膨脹、邊緣變銳。結扎右主支氣管扎并浸入10%甲醛、固定。14 d內實施脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.6.4SP法免疫組化檢測 將浸泡玻片以清潔劑刷洗，以流水沖凈后烤干，泡酸1 d并再次沖凈、烤干，以95%酒精浸泡12 h后烤干，再采用多聚賴氨酸浸泡并烤干。苯脫蠟，梯度酒精脫苯，并用蒸餾水清洗3 min，重復3次，以磷酸鹽緩沖液清洗5 min，滴加3%氧化氫試劑A。將其置于室溫下30 min，將內源性過氧化物酶去除，以磷酸鹽緩沖液清洗3 min，重復3次。在抗原修復液的容器中浸入切片，在溫度為98℃～100℃的微波爐中加熱7 min，操作2次，加熱后冷卻30 min于室溫環境下，用磷酸鹽緩沖液清洗3 min，重復3次。滴加正常山羊血清封閉液試劑B，置于室溫下孵育30 min。將多余液體甩去，滴加1∶50稀釋的一抗(兔抗鼠TNF-α多克隆抗體或鼠抗NF-κB克隆抗體)，于4℃下過夜。而后將其置于37℃下復溫45 min，用磷酸鹽緩沖液清洗3 min，重復3次。滴加50 μl Ⅱ抗試劑C，用磷酸鹽緩沖液清洗3 min，重復3次。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素染色試劑盒內試劑D，用磷酸鹽緩沖液清洗3 min，重復3次。DAB顯色，時間5～10 min，隨后將其置于流水下沖洗10 min，終止反應。蘇木素襯染90 s，蘭化5 min，鹽酸酒精分化10 s(30%鹽酸與75%酒精，體積比為1∶100)，水沖5 min，脫水、透明、封片。將其置于顯微鏡下觀察。以已知陽切片為陽性對照；以磷酸鹽緩沖液為陰性對照。以定位明確都的背景清晰、棕黃色細胞為陽性細胞計數，以連續切片400倍視野的HE染色結果計數視野細胞數10個，參考切片免疫組化結果，記錄NF-κB和TNF-α表達情況。每張切片隨機選擇5個視野于高倍鏡下，半定量分析表達強度。0分：未著色，1分：陽性細胞lt;總數25%，2分：彌漫性著為色弱陽性，3分：彌漫性著色為中等強度，4分：彌漫性著色為強陽性。

1.6.5RT-PCR法檢測 按美國Tripure RNA提取試劑盒操作說明進行總RNA提取，按大連寶生物RT-PCR劑盒操作說明進行RT-PCR提取。PCR擴增條件：2 min 94℃預變性，0.5 min 94℃變性，55℃退火0.5 min，72℃延伸1 min。循環28個后，72℃再延伸8 min。經瓊脂糖電泳PCR產物后，以凝膠掃描儀進行NDA電泳條帶光量子強度分析，以β-actin DNA電泳條帶光量子強度和TNF-α電泳條帶光量子強度比值為TNF-α mRNA 表達水平參數。由上海博亞公司合成引物。β-actin上游引物：5′-ATCATGTTTCAGACCTTCA-3′，下游引物：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，PCR擴增片段長度312 bp；TNF-α上游引物：5′-ACCCAAGCTTATGCACGGAAAGCATGATC-3′，下游引物：5′-CCCAAGCTTCACAGAGCAATGACTCCAA-3′，PCR擴增片段長度725 bp。

1.7統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組支氣管肺泡灌洗液白細胞總數和PMN、AM計數比較 與模型組相比，用藥組白細胞總數、PMN、AM計數顯著降低(Plt;0.001)。見表1。

2.2兩組TNF-α、NF-κB表達強度比較 與模型組相比，用藥組TNF-α、NF-κB表達強度顯著降低(Plt;0.001)。見表2，圖1。

2.3兩組TNF-α mRNA表達比較 與模型組(0.63±0.09)相比，用藥組TNF-α mRNA表達(0.50±0.07)顯著降低(t=21.558,P=0.000)。

表1 兩組支氣管肺泡灌洗液白細胞總數和PMN、AM計數比較

表2 兩組 TNF-α、NF-κB表達強度比較

圖1 NF-κB免疫組化染色(×200)

3 討 論

反復不斷的氣道感染和吸煙史是COPD發生與發展的主要原因，煙霧中含有大量的有害物質，如甲醛、氫氰酸、丙烯醛等，是氧化物的主要來源〔4〕。氧化物能促使組織產生炎癥細胞，會直接損傷肺組織，促使多種炎癥細胞浸潤肺間質和肺泡腔，而炎癥細胞能產生氧化物，誘導肺組織分泌、合成炎癥介質并損傷肺組織，形成惡性循環〔5,6〕。此外，香煙中的煙霧能造成下呼吸道對細菌感染的易感性增加，加重支氣管和肺損傷，對病變進展起到促進作用。脂多糖在內毒素對機體起致病性方面發揮重要的作用，其能促使中性粒細胞、上皮細胞、單核巨噬細胞等釋放炎癥因子，介導肺組織和氣道炎癥反應〔7,8〕。

TNF-α為炎性介質，能經誘導多種細胞因子并與其相互協同，促進炎癥反應；能造成中性粒細胞被激活，使其吞噬功能增強〔9〕。TNF-α的大量釋放和慢性刺激會造成組織免疫病理損傷。TNF-α過度表達會加重肺組織損傷，引起炎癥反應的慢性化〔10〕。NF-κB為DNA結合蛋白，能調控免疫細胞、肺炎癥和氣道上皮細胞中的黏附分子、細胞因子及趨化因子等的基因表達，參與肺部的免疫及炎癥反應〔11〕。COPD氣道炎癥的發生發展與NF-κB的活化有密切關系。TNF-α能增強氣道巨噬細胞、上皮細胞和肺組織中NF-κB活性。激活后的NF-κB，會促使炎癥細胞因子mRNA轉錄，而合成TNF-α、白介素-8等炎性細胞因子〔12〕。上述炎癥因子能使炎癥細胞活化，對炎性細胞的釋放、合成炎性介質發揮促進作用。本研究說明孟魯司特鈉能降低抑制NF-κB、TNF-α活性和TNF-α mRNA表達，對COPD具有一定的療效。孟魯司特鈉能競爭性的與白三烯受體結合，能經減少激活的淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞和細胞素、肥大細胞等炎癥標志物，降低氣道的高反應性〔13〕。其主要作用機制包括：①對氣道內脫顆粒和嗜酸粒細胞浸潤發揮抑制作用，避免細胞-EOS發揮作用；②對氣道上皮細胞生長因子受體表達起抑制作用，避免杯狀細胞化生；③避免LTD4刺激平滑肌細胞分裂〔14，15〕。孟魯司特鈉能避免氣道內聚集炎癥細胞，抑制巨噬細胞過氧化物、嗜酸粒細胞陽離子蛋白等炎癥介質釋放，發揮改善患者肺功能、減輕氣道炎癥等作用。本研究仍存在一定的不足之處，如研究樣本量較少，未分析孟魯司特鈉的作用強度是否與用藥劑量有關等，后期仍需深入研究。

1劉圣金，王 瑞，吳德康，等.礦物藥青礞石對AECOPD痰熱證大鼠肺組織NF-κB表達及血清中相關因子的干預作用〔J〕.中成藥，2017；39(2)：404-7.

2Zaitsev AA，Ovchinnikov YV，Bezlepko AV，etal.Clinical guidelines for management of patients with acute chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Voen Med Zh，2015；336(3)：31-7.

3陳曉明，張偉兵，田曉彥，等.鹽酸氨溴索對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織細胞凋亡和血清炎癥因子的影響〔J〕.臨床肺科雜志，2017；22(3)：526-31.

4Rajanandh MG，Nageswari AD，Ilango K.Pulmonary function assessment in mild to moderate persistent asthma patients receiving montelukast, doxofylline, and tiotropium with budesonide： a randomized controlled study〔J〕.Clin Ther，2014；36(4)：526-33.

5Jameel B，Tran H，Jersmann H，etal.Potential link between the Sphingosine-1-Phosphate (S1P) system and defective alveolar macrophage phagocytic function in chronic obstructive pulmonary disease (COPD)〔J〕.PLoS One，2015；10(10)： e0122771.

6吳成周.孟魯司特鈉治療穩定期慢性阻塞性肺疾病療效評價〔J〕.中國藥業，2017；26(2)：47-9.

7尚立芝，王 峰，謝文英，等.愛羅咳喘寧對慢性阻塞性肺疾病大鼠可溶性細胞間黏附分子1、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6及炎細胞的影響〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(17)：4762-4.

8Matsuse H，Kohno S.Leukotriene receptor antagonists pranlukast and montelukast for treating asthma〔J〕.Expert Opin Pharmacother，2014；15(3)：353-63.

9鄭少強，劉德綱.慢性阻塞性肺疾病大鼠血清和肺組織中IL-10、TNF-α及IFN-γ的表達及意義〔J〕.中國老年學雜志，2017；37(7)：1613-5.

10虞玉英，胡克崇，徐慧芳.布地奈德聯合孟魯司特鈉對慢性阻塞性肺疾病患者肺功能及血清中IL-6、IL-8和TNF-α的影響〔J〕.中國生化藥物雜志，2014；34(7)：153-5.

11王新杰.孟魯司特鈉聯合BiPAP呼吸機對COPD合并呼吸衰竭患者CRP、TNF-α、NT-proBNP的影響〔J〕.標記免疫分析與臨床，2016；23(9)：1024-6.

12龔 麗，羅百靈，張 姍.COPD患者肺組織中NF-κB和GRP78的表達水平及意義〔J〕.國際呼吸雜志，2017；37(1)：18-22.

13秦 艷.孟魯司特鈉治療慢性阻塞性肺疾病122例臨床療效觀察〔J〕.國際呼吸雜志，2016；36(9)：658-61.

14Liu JL，Zhao XH，Zhang DL，etal.Effect of montelukast on the expression of interleukin-18, telomerase reverse transcriptase, and Bcl-2 in the brain tissue of neonatal rats with hypoxic-ischemic brain damage〔J〕.Genet Mol Res，2015；14(3)：8901-8.

15屈 磊，龔傳明，章 濤，等.孟魯司特鈉對COPD急性發作患者肺功能及炎性介質的影響〔J〕.西南國防醫藥，2015；25(10)：1058-61.

〔2017-04-26修回〕

(編輯 滕欣航)

R563

A

1005-9202(2017)21-5264-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.020

1 武警四川總隊醫院ICU

胡建英(1967-)，女，副主任醫師，主要從事慢性阻塞性肺疾病的研究。