五味子乙素抗腎纖維化作用及機制研究*

鄭海洲，張杰，肖程程，秦聰，徐濤

（武漢大學人民醫院 泌尿外科，湖北 武漢 430060）

五味子乙素抗腎纖維化作用及機制研究*

鄭海洲，張杰，肖程程，秦聰，徐濤

（武漢大學人民醫院 泌尿外科，湖北 武漢 430060）

目的探討五味子乙素對腎纖維化的改善作用及其機制。方法以分別不同劑量的五味子乙素給缺血再灌注（I/R）模型小鼠灌胃。通過Masson染色對各組小鼠腎纖維化進行評價，免疫組織化學染色檢測各組小鼠腎組織α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）的表達；Western blot法檢測各組小鼠腎組織α-SMA、CollagenⅠ、上皮性鈣粘蛋白（E-cadherin）、轉化生長因子β1（TGF-β1）和p-Smad3的表達水平。結果Masson染色結果顯示，五味子乙素治療組較I/R組小鼠腎間質纖維化及小管萎縮減輕；免疫組織化學染色結果顯示，治療組較I/R組α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達減少；Western blot檢測結果顯示，治療組較I/R組E-cadherin表達增高，α-SMA、CollagenⅠ、TGF-β1和p-Smad3表達均下降，且呈現出劑量效應。結論五味子乙素具有抗腎纖維化的作用，其機制可能與抑制TGF-β/Smad信號通路有關，提示五味子乙素有望成為抗腎纖維化的臨床治療藥物。

腎纖維化；五味子乙素；缺血再灌注；治療

慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）全球患病率為8%～16%，已成為全球性公共衛生問題[1]。研究表明，超過60%的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）患者會逐漸發展為 CKD，CKD 患者更易發生AKI，AKI也會加速CKD進程[2-3]。腎間質纖維化是各種CKD發展為終末期腎衰竭的共同途徑[4]。因此，治療腎間質纖維化是預防與治療慢性腎臟疾病的關鍵。

腎小管上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腎間質纖維化發生、發展的重要機制，EMT是指腎小管上皮細胞的表型發生改變，喪失上皮細胞表型，獲得間質細胞特征[5]。大量研究表明，轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）是最主要的促纖維化因子，五味子乙素能通過抑制TGF-β1信號通路發揮抗血管纖維化作用[6]，五味子乙素還可減輕四氯化碳引起的肝細胞損傷，對缺血再灌注引起的心肌細胞損傷也有一定的保護作用[7]。五味子乙素對腎纖維化是否具有保護作用，目前尚無文獻報道。本實驗通過小鼠體內研究，探索五味子乙素對腎臟纖維化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與動物

20只健康雄性C57BL/6小鼠（購自武漢大學醫學院動物實驗中心，動物號：S0271605051A），體重20～25 g。五味子乙素（購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度＞98%），兔抗小鼠GAPDH、α-平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）、上皮性鈣粘蛋白（E-cadherin）、Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ）、轉化生長因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）和 p-Smad3 抗體（購自美國 Abcam公司），Masson染色試劑盒、DAB試劑盒、橄欖油、十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、Marker和BCA蛋白定量試劑盒（購自湖北省武漢谷歌公司），微量移液器（購自德國Eppendorf公司），離心機（購自德國Thermo公司），超級純水儀（購于美國Millipore公司），顯微鏡（購自日本Olympus公司），Odyssey雙色紅外熒光成像系統（購自美國LI-COR公司）。

1.2 分組及復制I/R模型

20只小鼠隨機分成4組：①假手術組（Sham）；②腎缺血再灌注模型組（I/R）；③低劑量治療組（五味子乙素10 mg/kg灌胃）；④高劑量治療組（五味子乙素20 mg/kg灌胃）；每組5只。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉，常規消毒，于左側肋緣下切開約1～1.5 cm，暴露左腎后仔細剔除腎蒂周圍脂肪組織以暴露血管，用微血管鉗夾閉血管25 min，以相同操作夾閉右側血管25min（右側切口比左側低約0.5 cm），血管夾閉1～2 min后可觀察到腎外觀逐漸由紅色變為深紫色。切口逐層縫合，75%酒精消毒后將小鼠置于恒溫孵化器中。Sham組僅剝離脂肪組織，不夾閉血管。治療組手術當天即開始給予藥物灌胃，持續15 d；Sham組及I/R組給予等量的橄欖油（10 ml/kg）灌胃 15 d。

1.3 取材

在I/R模型小鼠術后10周，戊巴比妥鈉腹腔麻醉后取小鼠左腎，頸椎脫臼處死小鼠。部分腎組織加4%的多聚甲醛固定以作病理分析，另一部分置于-80℃冰箱冷凍保存備用。

1.4 觀察各組腎組織纖維化程度

將4%多聚甲醛固定的腎組織石蠟包埋，切成4μm切片行Masson染色，顯微鏡下觀察，高倍視野下（×400），Masson染色膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色，藍染的間質膠原纖維越多，表示腎纖維化越嚴重。Image-ProPlus 6.0分析藍染區域所占面積比，實驗結果用陽性面積百分率（Per Area Obj/Total）表示。

1.5 免疫組織化學染色檢測各組腎組織α-SMA和CollagenⅠ的表達

組織切片，依次脫蠟、水化及抗原修復后，3%過氧化氫室溫孵育15 min，正常山羊血清封閉30 min，分別滴加 α-SMA（1∶100），Collagen Ⅰ（1∶150），4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5 min。辣根過氧化物酶標記二抗室溫下孵育10 min，PBS搖床漂洗，DAB染色后用蒸餾水沖洗2次終止反應，細胞核復染，梯度脫水后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，高倍視野（×400）腎間質內可見棕黃色條索、波紋狀染色為陽性表達。Image-Pro Plus 6.0分析α-SMA和CollagenⅠ陽性表達區域所占面積，實驗結果用陽性面積百分率（Per AreaObj/Total）表示。

1.6 Western blot檢測各組腎組織α-SMA、CollagenⅠ、E-cadherin、TGF-β1和p-Smad3的表達

將腎組織剪碎研磨，加蛋白裂解液提取細胞蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，提取的蛋白置于100℃恒溫器變性10 min。每孔20 μg蛋白的上樣量經SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h。TBST洗膜3次后放入相應的一抗中，4℃孵育過夜。次日取出，TBST清洗3次后放入二抗中，避光常溫孵育1 h，利用Odysey雙色紅外激光成像系統掃膜。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 五味子乙素減輕I/R小鼠模型腎損傷

Masson染色結果顯示：Sham組腎小球，腎小管形態、大小均正常，腎間質僅腎小球系膜及基底膜、腎小管基底膜及脈管區有藍色表達區域，未見纖維增生；I/R組術后10周，可見腎間質萎縮和壞死，間質大量炎癥細胞浸潤，藍染區域較Sham組增多，腎間質纖維化嚴重；五味子乙素治療組與I/R組比較，腎損傷程度減輕，膠原藍染面積減少（見圖1A）。各組膠原纖維陽性面積，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=201.584，P=0.000）。兩兩比較用LSD-t檢驗，I/R模型組較Sham組膠原纖維陽性面積增多（P=0.000）；治療組與I/R組比較，膠原纖維陽性面積減少（均P=0.000）。見圖1B。

2.2 五味子乙素調節I/R模型小鼠腎組織α-SMA和collagenⅠ的表達

各組小鼠腎組織α-SMA和CollagenⅠ的表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=90.850和 148.818，均P=0.000）。Sham 組腎組織α-SMA和CollagenⅠ表達較少，I/R組表達較Sham組增高（均P=0.000）。五味子乙素治療組α-SMA和CollagenⅠ表達較I/R組均減少（均P=0.000），高劑量組治療效果比低劑量組好。見圖2。

圖1 五味子乙素治療I/R模型小鼠的腎組織染色結果 （Masson染色×400）

圖2 五味子乙素調節I/R模型小鼠腎組織α-SMA和CollagenⅠ的表達 （免疫組織化學法×400）

2.3 各組小鼠腎組織 α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin的表達

術后10周，各組小鼠腎組織α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin蛋白相對表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=67.201、85.092及166.843，均P=0.000）。與Sham組比較，I/R組α-SMA和CollagenⅠ表達量增高（均P=0.000），與I/R組比較，治療組α-SMA和CollagenⅠ表達量減少（均P=0.000），且高劑量治療組表達量減少。上皮特征蛋白E-cadherin I/R組表達量較Sham組減少（P=0.000），治療組表達量比I/R組增高（均P=0.000）。見圖3。

圖3 各組小鼠腎組織α-SMA、CollagenⅠ和E-cadherin的表達

圖4 各組小鼠腎組織TGF-β1和p-Smad3的表達

2.4 各組小鼠腎組織TGF-β1、p-Smad3的表達

各組小鼠腎組織TGF-β1、p-Smad3蛋白相對表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=245.580和 175.083，均P=0.000）。Sham 組TGF-β1和p-Smad3無表達，I/R模型組表達較多（均P=0.000），治療組較I/R組表達量減少（均P=0.000）。見圖 4。

3 討論

腎間質纖維化是慢性終末期腎病的主要病理變化，也是各種慢性腎病的最終結果[1，4]。IRI病理變化是急性腎小管凋亡和壞死，是AKI的主要原因。腎臟發生缺血損傷后其功能可恢復正常，但成纖維細胞大量增殖、細胞外基質過度沉積，導致腎小管間質纖維化，最終進展為CKD[8]。EMT是腎間質纖維化的一個重要因素，包括上皮標志物的缺失如E-cadherin以及間質指標的增多，如α-SMA和CollagenⅠ等[9]。雖然輸尿管梗阻是建立小鼠腎纖維化模型的傳統方式，但臨床上由輸尿管梗阻導致的腎纖維化發生率較低[10]，而缺血再灌注損傷與臨床聯系緊密，AKI與CKD的病理相關性最近也已明確澄清，AKI患者比有CKD病史的患者更容易發生終末期腎臟病[11]。小鼠腎缺血再灌注模型十分契合急性腎損傷發展為慢性腎損傷的過程[11-13]。

TGF-β1調節細胞生長、纖維化和炎癥，在正?；驌p傷組織重塑中起著至關重要的作用，TGF-β1的異常調節常導致病理纖維化的細胞增殖和細胞外基質蛋白的過度積累[14-15]。TGF-β1是最重要的促腎纖維化因子，研究表明TGF-β1在激活下游Smad信號調節腎小管間質纖維化中起著重要作用，其機制可能是通過激活TGF-β/Smad信號途徑實現[5]。本實驗Western bolt結果顯示，發生纖維化組織中TGF-β1和p-Smad3蛋白的表達量會明升高。

五味子乙素是中藥五味子的主要活性成分，具有多種生物活性，包括抗氧化、抗炎以及抗腫瘤作用，對心、腦、肝和腎等多種器官均具有保護作用[16]。五味子乙素通過靶向針對TGF-β1，對腫瘤、血管損傷和原發性肺動脈高壓等均具有治療作用[17-18]。LEE等[19]研究發現，五味子乙素還可抑制炎癥和防止基質金屬蛋白酶的降解，對大鼠大腦缺血再灌注引起的神經損傷也具有保護作用。本研究中，I/R組Masson染色可見藍染的膠原纖維增多，間質炎癥細胞浸潤，腎間質結構嚴重破壞，腎小管明顯萎縮和壞死；免疫組織化學染色及Western blot檢測間質指標蛋白α-SMA和CollagenⅠ，I/R組表達較Sham組均升高，說明本實驗通過I/R成功構造腎纖維化模型。用五味子乙素作為治療藥物逆轉腎纖維化，從免疫組織化學及Western blot結果可以看出五味子乙素有治療作用，五味子乙素通過抑制TGF-β1的表達，進而抑制p-Smad3的表達。

綜上所述，在小鼠腎缺血再灌注損傷模型中，五味子乙素具有抗腎纖維化作用，其機制可能是通過抑制TGF-β/Smad信號通路，抑制細胞外基質堆積和上皮間質轉化，從而減輕腎缺血再灌注損傷引起的腎小管間質纖維化，并提示五味子乙素有望成為抗腎纖維化的臨床治療藥物，為腎纖維化的防治提供新的思路和途徑。

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（王榮兵 編輯）

Protective effect of Schisandrin B on renal fibrosis and underlying mechanism*

Hai-zhou Zheng,Jie Zhang,Cheng-cheng Xiao,Cong Qin,Tao Xu
(Department of Urology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan,Hubei 430060,China)

ObjectiveTo investigate the protective of Schisandrin(Sch B)on renal fibrosis and underlying mechanism.MethodsMice were subjected to ischemia-reperfusion (I/R)injury in presence or absence of Sch B.Masson staining was performed for morphological grading of renal fibrosis.α-SMA and Collagen I expression in kidney tissue were determined by Immunohistochemistry.The expression levels of α-SMA,collagenⅠ,E-cadherin,transforming growth factor β1(TGF-β1)and p-Smad3 were measured by Western blot.ResultsRenal fibrosis and tubular atrophy were significantly alleviated by Sch B treatment when compared with I/R group.Immunohistochemistry staining showed that α-SMA and Collagen I in the I/R group increased significantly,which was attenuated by Sch B.Western blot suggested that,in the Sch B group,the expression of E-cadherin was increased while α-SMA,Collagen I,TGF-β1and p-Smad3 decreased dramatically in a dose dependent manner in comparison with those in the I/R group.ConclusionsData confirms that SchB can ameliorate renal fibrosis by inhibiting TGF-β/Smad signaling pathway,which could be a potential therapeutic intervention for renal fibrosis.

renal fibrosis;Schisandrin B;ischemia reperfusion

R692

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.001

1005-8982（2017）27-0001-06

2017-06-01

國家自然科學基金（No：81470923）

張杰，E-mail：zhangjiewhu666@163.com