草蓯蓉環烯醚萜苷對二乙基亞硝胺誘發肝癌大鼠細胞凋亡的影響*

崔香丹 ，鄭峰 ，朱潔波 ，全吉淑 ，尹學哲

（1.延邊大學附屬醫院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學基礎醫學院，吉林 延吉 133000）

草蓯蓉環烯醚萜苷對二乙基亞硝胺誘發肝癌大鼠細胞凋亡的影響*

崔香丹1，鄭峰1，朱潔波1，全吉淑2，尹學哲1

（1.延邊大學附屬醫院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學基礎醫學院，吉林 延吉 133000）

目的觀察二乙基亞硝胺（DEN）誘發大鼠肝癌的病理變化，探討草蓯蓉環烯醚萜苷（IGBR）對細胞凋亡的作用及對p53、Bcl-2蛋白表達的影響。方法132只Wistar雄性大鼠隨機分為對照組、模型對照組、陽性對照組及IGBR組。除對照組，各組大鼠給予DEN 0.2 g/kg腹腔注射1次，而后0.05%的DEN水溶液用于自由飲水；陽性對照組腹腔注射5-氟尿嘧啶（5-FU）0.025 g/kg每周3次；IGBR組每日IGBR 0.5 g/kg灌胃1次。實驗第12、20及28周末，分批處死動物，觀察肝臟病理變化及細胞凋亡，免疫組織化學法和Western blot檢測p53、Bcl-2的表達。結果與對照組比較，模型對照組肝細胞核大且深染，肝細胞變性、異型增生，有些增生灶可見癌變細胞。凋亡的肝細胞皺縮、核固縮及核仁消失。IGBR組與陽性對照組凋亡指數高于模型對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），但兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。免疫組織化學結果，p53和Bcl-2陽性細胞主要分布于不典型增生灶和癌灶的胞漿中。與模型對照組比較，IGBR組和陽性對照組p53表達強度增強，而Bcl-2表達強度減弱，差異有統計學意義（P＜0.05），IGBR組和陽性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論大鼠肝癌發生與細胞凋亡相關，IGBR通過調控p53、Bcl-2來抑制DEN誘發大鼠肝癌。

肝癌；草蓯蓉環烯醚萜苷；凋亡；p53；Bcl-2

如今，原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發生呈迅猛的增加趨勢[1]，世界衛生組織揭曉的《全球癌癥報告》表明，肝癌的新發和死亡人數中國居世界第一[2]。惡性腫瘤的發生與細胞凋亡和增殖緊密相關[3]。細胞凋亡是由基因調控引起的細胞環境和死亡信號變化引起的程序性細胞死亡過程。腫瘤細胞與實體腫瘤中都存在細胞凋亡，且凋亡程度的好壞直接與腫瘤的發展程度相關。

草蓯蓉為中國傳統的民族藥，民族藥名為不老草，為我國2類保護植物，是大興安嶺高山地區、長白山特有植物，可全草入藥。傳統醫藥典籍記載其有補腎壯陽、潤腸通便、滋補強身、延緩衰老之功效[4]。草蓯蓉環烯醚萜苷（iridoid glucosidesfrom bosch niakia rossica，IGBR）是草蓯蓉提取物，具有抗癌、清除自由基及誘導凋亡等作用[5]。目前對IGBR抗癌機制方面的研究受到廣泛的關注。通過觀察二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）引發大鼠肝癌中IGBR對細胞凋亡的作用，闡明其抗癌機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Wistar大鼠和 IGBR（延邊大學提供），DEN（購自Sigma公司），p53、Bcl-2蛋白多克隆抗體、TUNEL和免疫組化試劑盒（購自北京中杉金橋），β-actin（Cell Signaling Technology公司提供），γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl-transferase，γ-GT）試劑盒（購自凱基生物科技有限公司）。

1.2 模型的復制與分組

Wistar雄性大鼠132只，分為4組，對照組大鼠給予生理鹽水0.1 ml/100 g體重腹腔注射1次；模型對照組、陽性對照組、IGBR組大鼠第1天給予DEN 0.2 g/kg腹腔注射1次，然后0.05%的DEN水溶液用于自由飲水；陽性對照組大鼠腹腔注射5-氟尿嘧啶（5-FU）0.025 g/kg每周3次；IGBR組大鼠每日灌胃IGBR 0.5 g/kg。實驗第12、20周末各組處死6只、28周末各組處死20只，取心臟血，肝臟甲醛固定，石蠟包埋。

1.3 檢測方法

按γ-GT試劑盒的操作步驟測定血清中γ-GT，HE染色觀察肝臟病理變化，TUNEL法檢測肝細胞的凋亡，凋亡指數（apoptoticindex，AI）=×100%免疫組織化學法和Western blot法檢測p53和Bcl-2蛋白的表達。

1.4 統計學方法

數據處理采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析和χ2檢驗，計數資料以率（%）表示，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IGBR對DEN誘發肝癌大鼠血清γ-GT含量的影響

大鼠誘癌過程中28周末，4組間γ-GT比較，差異有統計學意義（F=1111.237，P=0.000）；與對照組比較，模型對照組γ-GT增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型對照組比較，陽性對照組與IGBR組γ-GT下降，兩組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 肝臟組織HE染色

肝小葉和肝索排列正常，可見中央靜脈，細胞核清晰。模型對照組肝臟病理改變主要表現為肝臟炎癥反應、肝硬化和肝癌。根據不同的病理變化將模型對照組病理變化分為3個階段：①肝炎階段（12周）：可見炎癥反應、壞死和淋巴細胞浸潤、膠原沉積及凋亡小體；②肝硬化階段（20周）：可見結節性肝細胞再生，不同大小的肝結節，肝小葉正常結構破壞、肝索排列紊亂；③肝癌階段（28周）：可見肝細胞核深染，肝細胞變性、增生，部分可見癌細胞增生。IGBR組及陽性對照組肝小葉破壞及肝索排列紊亂程度、細胞變性及異性增生度較模型對照組各階段均減輕，IGBR組和陽性對照組差異無統計學意義。

表1 各組大鼠γ-GT、AI值的比較 （n=6，±s）

表1 各組大鼠γ-GT、AI值的比較 （n=6，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與模型對照組比較，P ＜0.05

組別γ-GT/（U/L）AI/%對照組 38±3 1.5±0.6模型對照組 97±131） 12.3±0.41）陽性對照組 91±52） 22.3±0.22）IGBR 組 97±52） 22.2±0.12）

2.3 肝細胞凋亡染色

對照組大鼠肝細胞凋亡稀少，著色淺；模型對照組細胞凋亡率增加，胞質呈棕黃色，凋亡的肝細胞故縮、核濃縮、核仁消失。4組的AI比較，差異有統計學意義（F=42 542.984，P=0.000）；IGBR 組與陽性對照組AI差異無統計學意義（P＞0.05），但高于模型對照組，且差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表2 各組大鼠肝癌階段肝組織中p53表達率的比較（n=20）

2.4 p53和Bcl-2免疫組織化學染色結果

p53和Bcl-2陽性細胞主要分布于癌灶的胞漿中（見表2、3和圖 1、2）。3組p53表達率的比較，差異有統計學意義（χ2=11.971，P=0.046）；3組 Bcl-2表達率比較，差異有統計學意義（χ2=34.159，P=0.000）。較模型對照組比較，IGBR和陽性對照組p53表達增強，而Bcl-2表達減弱，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 p53和Bcl-2表達水平比較

4組p53的比較，差異有統計學意義（F=2201.596，P=0.000），但兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。4組Bcl-2的比較，差異有統計學意義（F=2 838.713，P=0.000）。與對照組比較，模型對照組p53和Bcl-2表達水平升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，IGBR組和陽性對照組p53表達水平升高，而Bcl-2表達水平降低（P＜0.05），兩組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

表3 各組大鼠肝癌階段肝組織中Bcl-2表達率的比較（n=20）

圖1 肝組織p53免疫組織化學觀察結果 （×100）

圖2 肝組織Bcl-2免疫組織化學觀察結果 （×100）

圖3 肝組織p53、Bcl-2 Western blot觀察結果

3 討論

肝癌的發生機制非常復雜，有大量的研究表明，抗凋亡因子在腫瘤細胞株和實體腫瘤中表達增加。DEN誘發的大鼠肝癌多為肝細胞肝癌，造模簡單易成功。張志敏等[7]觀察到，DEN誘癌過程與人類肝細胞癌進程相似。本實驗造模過程中28周（肝癌階段）時血清γ-GT增高，且HE染色肝細胞核大、深染、變性、異型增生，部分可見癌變細胞，說明DEN誘發大鼠肝癌模型制作成功。

細胞凋亡是細胞程控性死亡，調控機體發育和內環境穩定[6-7]。p53與Bcl-2調節細胞凋亡與增殖，且在凋亡進程中相互影響[8]。

p53是抑癌基因，半數以上的人類癌癥有p53的缺失和突變。突變型p53促進細胞生長、抑制細胞凋亡，導致基因異常表達，使細胞癌變[9-11]。各種應激使p53被不同的信號通路激活，引發下游的基因轉錄，導致細胞凋亡[12]。研究表明，p53基因失活與肝癌的形成與預后相關[13]。在慢性肝損傷中，肝細胞發生依賴p53的衰老程序，肝硬化的風險大大增加；另外，缺失p53表達的上皮細胞更易轉化為肝癌[14]。

Bcl-2是原癌基因，通過調控凋亡信號而抑制細胞凋亡，還與細胞異常增殖有關，與肝癌的發生緊密相關[15]。Bcl-2高表達轉錄因子，促進其過多釋放及無限制地轉錄，使量變誘發質變而導致腫瘤發生[16]。另外，Bcl-2與癌基因C-myc[17]和抗癌基因p53[18]互相作用，間接控制細胞程序性死亡。

本研究結果顯示，DEN誘發的大鼠肝組織中p53和Bcl-2均表達增強，免疫組織化學和Western blot檢測結果示IGBR與5-FU干預后，p53表達增強，而Bcl-2表達下降。IGBR和5-FU是通過介導抑癌基因和癌基因的表達而實現誘導大鼠肝癌細胞凋亡。已有研究證明5-FU為傳統抗癌藥，本研究結果IGBR與5-FU作用無差異，進一步證實IGBR的抗癌作用。

本研究中，通過IGBR對大鼠肝癌的影響，進一步闡明IGBR抗肝癌機制，對中醫在誘導腫瘤細胞凋亡的機制進行深入研究，并為中醫抗腫瘤提供科學依據。

[1]SMITH W A, LI C, NOTTAGE K A, et al. Lifestyle and metabolic syndrome in adult surviv-ors of childhood cancer: a report from the st: jude lifetime cohort study[J]. Cancer, 2014,120(17): 2742-2750.

[2]陳萬青,張思維,曾紅梅,等.中國2010年惡性腫瘤發病與死亡[J].中國腫瘤,2014,23(1):1.

[3]FAQABREQAT I, RONCERO C, FERNANDEZ M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer [J]. Liver Int,2007, 27(2): 155-162.

[4]中華本草編委會.中華本草[M].第20版.上海:上海科學技術出版社,2002:507.

[5]尹學哲,許惠仙,金愛花,等.草蓯蓉環烯醚萜苷對肺癌細胞增殖和凋亡影響[J].中國公共衛生,2010,26(7):805-806.

[6]TOMEK M, AKIYAMA T, DASS C R, et al. Role of Bcl-2 in tumour cell survival and implications for pharmacotherapy [J]. J Pharm Pharmacol, 2012, 64(12): 1695-1702.

[7]XIAO Z, SHAN J, LI C, et al. Mechanisms of cyclosporine-induced renal cell apoptosis: a systematic review[J]. Am J Nephrol,2013, 37(1): 34-40.

[8]林慶新.黃連素誘導人肝癌HepG2細胞凋亡及其機制研究[J].中藥材,2015,38(7):1499-1501.

[9]張勤,劉紅.P53在三陰性乳腺癌中的表達及臨床意義[J].中國腫瘤臨床,2011,38(4):214-217.

[10]FEMANDEZ-CUESTA L, ANAGANTI S, HAINAUT P, et al.Estrogen levels act as arheost-at on p53 levels and modulate p53-dependent responses in breast cancer cell lines [J]. Breast Cancer Res Treat, 2011, 125(1): 35-42.

[11]WALERYCH D, NAPOLI M, COLLAVIN L, et al. The rebel angel: mutant p53 as the driving oncogene in breast cancer[J].Carcinogenesis, 2012, 33(11): 2007-2017.

[12]MARCEL V, CATEZ F, DIAZ J J. p53, a translational regulator:contribution to its tumor-su ppressor activity[J]. Oncogene,2015, 34(44): 5513-5523.

[13]ZHANG Q, LIU J, LIU B, et al. Dihydromyricetin promotes hepatocellular carcinoma regre-ssionvia a p53 activation-dependent mechanism[J]. Sci Rep, 2014, 4(4): 4628.

[14]LUJAMBI O, AKKARI L, SIMON J, et al. Non-cell-autonomous tumor suppression by p53[J]. Cell, 2013, 153(2): 449-460.

[15]RODRIGUEZA WV, WOOLLISCROFT MJ, EBRAHIM AS, et al.Development and anti-tumor activity of a BCL-2 targeted singlestranded DNA oligonucleotide[J]. Cancer Chemot-her Pharmacol,2014, 74(1): 151-166.

[16]MULLER P A, VOUSDEN K H, NORMAN J C. p53 and its mutants in tumor cell migration and invasion [J]. J Cell Biol,2011, 192(2): 209-218.

[17]DEMR D, YAMAN B, ANACAK Y, et al. Prognostic signifi-cance of bcl-2, c-myc, survivin and tumor grade in synovial sarcoma[J]. Turkish Journal of Pathology, 2014, 30(1): 55-65.

[18]NAKAZAWA K, DASHZEVEG N, YOSHIDA K. Tumor suppressor p53 induces miR-1915 processing to inhibit Bcl-2 in the apoptotic response to DNA damage[J]. FEBS J, 2014, 281(13):2937-2944.

（王榮兵 編輯）

Effect of Iridoid Glucosides from Boschniakia Rossica on rat models of diethylnitrosamine-induced hepatocarcinomat*

Xiang-dan Cui1,Feng Zheng1,Jie-bo Zhu1,Ji-shu Quan2,Xue-zhe Yin1
(1.Yanbian University Hospital,Yanji,Jilin 133000,China;2.Yanbian University Medical School,Yanji,Jilin 133000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Iridoid Glucosides from Boschniakia Rossica (IGBR) on apoptosis and the expression of p53 and Bcl -2 proteins.MethodsA total of 132 Wistar male rats wererandomly divided into control group, model group, positive control group and IGBR group. DEN was administered once by intraperitoneal injection (0.2 g/kg), then through drinking water (0.05%) for the rest of experimental duration in each group except for the control group. Animals from the positive control group was injected with 5-FU 3 times per week (0.025 g/kg). Rats in the IGBR group were treated intragastrically with IGBR daily (0.5 g/kg). Animals were sacrificed on 12, 20 or 28 weeks post insults. Pathological alterations and apoptosis of liver cells were observed and expression of p53 as well as Bcl -2 were determined by Immunohistochemistry and Western blot.ResultsCompared with the control group, the enlarged and deeply stained nuclei, hepatocellular degeneration, dysplasia and cancer cell were observed in the liver tissue of the model group. Apoptotic hepatocyte showed cytoplasmic and nuclear shrinkage without nucleolus. Immunohistochemistry results showed that p53 and Bcl -2 positive signals were mainly distributed in the cytoplasm of atypical hyperplasia and carcinoma.Expression of p53 increased while Bcl-2 decreased in the IGBR group as well as the positive control group significantly compared with the model group(P＜0.05).No obvious differences were observed between the IGBR group and the positive control group (P＞0.05).ConclusionsHepatocarcinoma is closely associated with apoptosis,and IGBR inhibits DEN-induced hepatocarcinoma through mediating p53 and Bcl-2 pathway.

hepatocarcinoma; Iridoid Glucosides from Boschniakia Rossica (IGBR); apoptosis; p53; Bcl-2

R285.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.002

1005-8982（2017）27-0007-05

2017-05-23

國家自然科學基金（No：81360651）

尹學哲，E-mail：yinxz@ybu.edu.cn；Tel：0433-2660004，15526770004