參芍口服液對糖尿病腎病大鼠腎臟內質網應激因子GRP78、PERK及CHOP表達的影響

遠迪 ，董云朋 ，曾招軍 ，黃安靜 ，張春來 ，周洪霞

（1.華北理工大學，河北 唐山 063000；2.河北省唐山工人醫院 心內四科，河北 唐山 063000）

參芍口服液對糖尿病腎病大鼠腎臟內質網應激因子GRP78、PERK及CHOP表達的影響

遠迪1，董云朋1，曾招軍1，黃安靜1，張春來2，周洪霞2

（1.華北理工大學，河北 唐山 063000；2.河北省唐山工人醫院 心內四科，河北 唐山 063000）

目的觀察參芍口服液對糖尿病腎病大鼠腎臟內質網應激標志性因子GRP78、PERK及CHOP表達的影響。方法將30只健康雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組（Sham組）、模型組（DN組）和參芍口服液組（SS組）。DN組和SS組予以高脂飼料加鏈脲佐菌素腹腔注射復制糖尿病腎病模型。SS組每日1次給予參芍口服液（250 mg/kg）灌胃，Sham組和DN組每日1次給予等劑量的蒸餾水灌胃。12周后檢測各組血糖、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）及24 h尿蛋白定量（PRO）；HE染色光鏡下觀察大鼠腎組織病理形態學改變；Western blot檢測大鼠腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白表達情況；TUNEL染色檢測大鼠腎組織細胞凋亡情況。結果DN組血糖、BUN、Scr及PRO與Sham組相比均增高，SS組血糖、BUN、Scr及PRO與DN組相比均降低（P＜0.05）。HE發現Sham組大鼠腎組織形態結構清楚，未見異常；DN組可見腎小球體積增大，可見大量炎癥細胞浸潤，腎小球系膜基質區增生，腎小管基底膜增厚，部分腎小球、腎小管出現纖維化；SS組腎組織病理形態變化輕于DN組。Western blot發現DN組腎臟組織GRP78、PERK及CHOP蛋白表達高于Sham組，SS組腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白表達均低于DN組（P＜0.05）。TUNEL發現DN組較Sham組腎臟組織存在更多細胞凋亡；SS組凋亡細胞少于DN組。結論參芍口服液可減輕糖尿病腎病大鼠腎臟病理損害，延緩腎功能減退，具有腎保護作用，其機制可能與降低內質網應激相關因子GRP78、PERK及CHOP的表達及減少腎組織細胞凋亡有關。

參芍口服液；糖尿病腎??；內質網應激；細胞凋亡；PERK；大鼠

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者重要的并發癥之一，DN進展為慢性腎衰竭的比例逐年升高，是導致終末期腎衰竭的主要原因[1-2]。其發病機制復雜目前還未明確。近年來發現，內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）與糖尿病腎病的發生有密切關系[3]。研究表明[4]，高血糖可誘發ERS，內質網應激及其介導的細胞凋亡在DN發生、發展中起重要作用，內質網應激是DN的重要發病機制。中醫認為“脾腎氣虛，痰瘀阻絡”是糖尿病腎病發病的重要原因，研究發現中藥在DN的早期防治有獨特優勢，可使糖尿病腎病的進展得到有效延緩[5-6]。參芍口服液是復方制劑，具備活血化瘀、益氣通絡之功效，以丹參、黃芪、赤芍及水蛭等主要成分精制而成[7]。研究已明確，參芍口服液可通過抑制DN病變過程中炎癥因子的表達，改善糖尿病大鼠早期腎臟損害的作用。但參芍口服液是否能通過對糖尿病腎病內質網應激的影響發揮對腎功能的保護作用及作用機制目前尚不明確。本文從內質網應激的角度，研究觀察參芍口服液對糖尿病腎損害大鼠腎臟內質網應激標志性因子GRP78、PERK及CHOP表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡30只健康Wistar雄性大鼠，無特定病原體（SPF）級，體重120～160 g；由華北理工大學動物中心提供（環境設施合格證號：028）。

1.2 藥物與試劑

參芍口服液（唐山市工人醫院制劑室，批號：Z20050957）藥物成份：丹參 250 g，黃芪 250 g，赤芍150 g，當歸 150 g，川芎 75 g，桃仁 125 g，紅花 75 g，水蛭187.5 g，地龍250 g，清半夏125 g。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國 Sigma公司），血糖儀及血糖試紙（美國強生公司），免疫印跡試劑盒（上海碧云天生物公司），兔抗鼠GRP78抗體（美國Abcam公司），兔抗鼠PERK抗體及CHOP抗體（美國Abcam公司），TUNEL凋亡檢測試劑盒（美國ROCHE公司）。

1.3 動物分組及模型復制

將30大鼠隨機分為正常對照組（Sham組）、模型組（DN組）、參芍口服液組（SS組），各10只，Sham組以普通飼料喂養，DN組和SS組采用高脂飼料喂養。DN組和SS組禁食12 h后，予以一次性STZ（25 mg/kg）腹腔注射制備糖尿病腎病模型，分別于第2、3及14天，連續3次監測血糖≥16.7 mmol/L，并伴有多飲、多尿、多食，收集尿液測尿糖為+++、++++（強陽性），24 h尿蛋白定量 ＞30 mg/24 h，為造模成功。造模過程中，DN組和SS組各有1只大鼠血糖不符合模型標準和各有1只大鼠死亡，均被剔除。最終共26只大鼠（Sham組10只、DN組8只、SS組8只）納入實驗。

1.4 藥物干預

造模后各組大鼠灌胃給藥，SS組大鼠每天1次250 mg/kg參芍口服液灌胃，Sham組和DN組每天1次等劑量的蒸餾水灌胃，共12周。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 血糖及腎功能指標檢測 于給藥12周用代謝籠采集大鼠24 h尿液，腹主動脈取血3 ml，監測各組大鼠血糖、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）水平、24 h 尿蛋白定量（proteinuria，24 h PRO）。

1.5.2 腎臟組織病理學檢查 在采集血、尿標本后處死各組大鼠，取出腎組織，一部分制作成石蠟塊，另一部分標本置于-80℃冰箱保存備用。將石蠟塊包埋的腎組織切成4μm厚度切片，進行HE染色，按常規脫蠟，經蘇木素染色、返藍、伊紅染色、再經乙醇、二甲苯沖洗及封片等步驟。顯微鏡下觀察腎組織病理學改變。

1.5.3 腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白水平表達的檢測 應用Western blot法，將腎組織取出，提取蛋白，取樣品蛋白加入上樣緩沖液，放到電泳槽上進行凝膠電泳，電泳結束后，將分離的蛋白條帶轉印至PVDF膜上，封閉，再分別加入一抗GRP78、PERK及CHOP抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育，洗膜，最后用生物凝膠圖像分析系統軟件進行蛋白定量分析，以目的條帶與GAPDH條帶的比值作為蛋白相對表達量。

1.5.4 大鼠腎臟細胞凋亡情況的檢測 將腎組織石蠟塊包埋后切片，進行TUNEL染色，按試劑盒說明書進行操作過程，經過烤片、脫蠟、孵育、沖洗、顯色、細胞核復染及封片等步驟，顯微鏡下觀察腎組織細胞凋亡情況。

1.6 統計學方法

數據處理采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 參芍口服液對血糖及腎功能的影響

DN 組的血糖、BUN、Scr、24 h PRO 水平與 Sham組相比均增高（P＜0.05），SS組上述指標的水平均低于DN組（P＜0.05），見附表。

附表 各組大鼠血糖、及腎功能指標比較 （±s）

附表 各組大鼠血糖、及腎功能指標比較 （±s）

注：1）與 Sham 組比較，P ＜0.05；2）與 SS組比較，P ＜0.05

組別 血糖/（mmol/L）BUN/（mmol/L）Scr/（μmol/L）24 h PRO/（mg/d）Sham 組 7.72±0.38 8.38±0.80 51.38±1.09 19.34±1.16 DN 組 26.90±1.021） 18.15±0.871） 76.55±1.191） 47.54±2.401）SS 組 22.38±0.552） 15.71.±0.812） 64.75±1.712） 39.88.±1.172）F值 1 982.617 348.692 798.807 719.420 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 參芍口服液對腎組織病理形態學改變的影響

HE染色示，Sham組可見大鼠腎組織結構清楚未見明顯異常；DN組可見大鼠腎小球體積明顯增大及大量炎細胞浸潤，腎小球系膜基質及細胞外基區質增生，腎小管基底膜變厚，腎小管上皮細胞出現空泡變性及管腔炎細胞浸潤，部分腎小球、腎小管纖維化；SS組與DN組相比腎小球及腎小管病理變化明顯減輕。見圖1。

2.3 參芍口服液對大鼠腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白水平表達的影響

Western blot結果示，DN組腎組織 GRP78、PERK和CHOP蛋白表達水平比Sham組增加（P＜0.05）；與 DN 組比較，SS組腎組織 GRP78、PERK 和CHOP蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見圖2。

2.4 參芍口服液對大鼠腎組織細胞凋亡變化的影響

圖1 各組大鼠腎組織病理學改變 （HE×400）

圖2 各組大鼠腎組織GRP78、PERK、CHOP的表達 （Western blot法檢測）

TUNEL染色檢測各組大鼠腎組織細胞凋亡情況，顯微鏡下觀察顯示，TUNEL染色定位于細胞核內，細胞核呈棕黃色為陽性細胞，正常細胞核顯色為藍色。Sham組大鼠腎組織細胞可見少量凋亡細胞；與Sham組比較，DN組大鼠腎組織可見腎小球和腎小管均有大量凋亡細胞；SS組較DN組凋亡細胞減少。見圖3。

3 討論

糖尿病腎病是以蛋白尿和腎功能逐漸下降為主要臨床表現，成為導致糖尿病患者死亡的重要原因，臨床尚未有明確有效的治療方法，近年來對其發病機制及防治方法的研究成為人們研究的焦點[8]。大量的臨床實踐研究發現，以益氣活血化瘀為理念，中藥在改善DN的臨床癥狀、延緩腎功能下降等方面具有明顯優勢[9-10]。參芍口服液是以活血化瘀為治療原則，兼以補氣通絡為法以丹參、黃芪、川芎、地龍及水蛭等為主要成分研究而成的中藥復方制劑，具備活血化瘀、抗氧化應激和抑制纖維化等作用[7，11]，參芍口服液符合中醫治療本虛標實慢性腎病病變以補氣活血為主的理論。參芍口服液已被證明具有抑制炎癥因子表達，減輕腎臟纖維化，改善腎功能作用。因此推測參芍口服液可通過抑制內質網應激，減少腎臟細胞的凋亡，改善DN腎功能從而起腎保護作用。

目前，愈來愈多的研究證明[3,12]，內質網應激介導的凋亡可能是導致糖尿病腎病的重要機制。內質網是蛋白質合成轉運的重要場所，在受到外界因素的影響下，蛋白質的正確折疊受到干擾，內質網穩態被打破失衡，即內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。適度的ERS可以恢復內質網穩態；過度的ERS就會啟動內質網膜上3種跨膜蛋白：跨膜蛋白激酶1（IRE1）、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣激酶（PERK）和活化轉錄因子6（ATF6）介導的3條信號通路誘導細胞凋亡。腎臟細胞具有豐富而復雜的內質網結構，高血糖和蛋白尿是誘發內質網應激的重要因素，因此，糖尿病時腎臟細胞極易發生內質網應激，長期高血糖和蛋白尿引發內質網應激，內質網膜上的3種膜蛋白介導的凋亡途徑被上調激活誘導細胞凋亡，造成腎臟細胞大量凋亡[12]。魏靜[4]等發現，糖尿病腎病小鼠腎功能的惡化與內質網應激導致的腎臟細胞的凋亡可能有密切關系，證實持續存在的ERS參與DN的發生且細胞凋亡可能是DN腎功能減退的重要因素。

GRP78是內質網應激中是一個重要的分子伴侶蛋白，屬于熱休克蛋白家族成員，大量研究顯示他在內質網應激相關疾病中大量表達，GRP78被認為是內質網應激發生和存在的標志蛋白[8]。FUKAMI等[13]發現，AGEs引起大鼠足細胞GRP78表達上調，誘發ERS，通過一系列反應激活凋亡基因導致足細胞凋亡。PERK通路是內質網應激最重要的通路，也是ERS時最先啟動的通路[14]。內質網應激狀態時，GRP78從PERK上解離大量表達，PERK通過自身磷酸化激活，進一步激活下游的一系列反應上調活化轉錄因子4（ATF4），進而激活生長停滯及損傷基因（CHOP）誘導細胞凋亡[12]。CHOP是介導ERS介導凋亡的關鍵蛋白也是ERS的一個重要中間信號分子，可被多個通路激活，PERK/ATF4是其表達的主要通路。陳玉鳳等[3]發現糖尿病腎病小鼠腎組織GRP78、PERK表達水平提高，CHOP轉錄活性增強，并伴有腎小球硬化。敲除CHOP基因后小鼠上述指標表達降低，腎臟病變減輕。NIE等[5，10]研究發現，在誘導的大鼠糖尿病模型中存在細胞凋亡的現象，并且在腎小球和腎小管部位的GRP78表達量增加，和CHOP呈正相關。本研究結果觀察發現，模型組大鼠出現大量蛋白尿，血糖、BUN及Scr水平升高及腎小球體積增大及大量炎細胞浸潤，腎小球系膜基質及細胞外基質區增生，腎小管基底膜增厚及上皮細胞出現空泡和炎細胞浸潤，部分腎小球和腎小管出現纖維化等糖尿病腎病表現；大鼠腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白水平表達升高，腎組織出現大量細胞凋亡。提示糖尿病大鼠腎臟處于內質網應激狀態，GRP78表達上調，進而通過PERK/ATF4通路激活CHOP基因誘導細胞凋亡。參芍口服液組大鼠血糖、BUN及Scr水平降低，24 h PRO下降，大鼠腎臟病理損害及腎功能得到改善，腎組織GRP78、PERK及CHOP蛋白水平表達降低及腎組織細胞凋亡減少。提示參芍口服液可能通過下調內質網應激GRP78、PERK蛋白的表達，進而減少CHOP基因的激活，減輕糖尿病腎病大鼠腎組織的內質網應激，抑制腎臟細胞凋亡，延緩腎功能減退發揮腎保護作用，從而起到延緩DN的發生、發展的作用。

綜上所述，參芍口服液能夠降低糖尿病大鼠血糖和蛋白尿，提高腎功能，延緩糖尿病腎病的進程，其機制可通過抑制大鼠腎臟內質網應激及減少腎組織細胞凋亡有關，為臨床早期防治糖尿病腎病提供新思路和其臨床用藥提供實驗基礎。

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（王榮兵 編輯）

Effect of Shenshao oral liquid on expression of GRP78,PERK and CHOP in rat models of diabetic nephropathy

Di Yuan1,Yun-peng Dong1,Zhao-jun Zeng1,An-jing Huang1,Chun-lai Zhang2,Hong-xia Zhou2
(1.North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China;2.Tangshan Workers'Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Shenshao oral liquid on expression of endoplasmic reticulum stress factors GRP78,PERK and CHOP in rat models of diabetic nephropathy.MethodsA total of 30 healthy male Wistar rats were randomly divided into Sham group,model group (DN group)and Shenshao oral liquid group (SS group).Animals in DN group and SS group were fed with high fat diet in addition to intraperitoneal injection of streptozotocin.Rats in SS group were administrated with Shenshao oral liquid(250 mg/kg)daily,and distilled water were administered daily into rats from Sham group and DN group.Blood glucose,blood urea nitrogen (BUN),creatinine (Scr)and 24-hour urinary protein (PRO)were measured 12 weeks post insults.Histopathological changes in renal tissue were graded through HE staining.Expression levels of GRP78,PERK and CHOP in kidney were measured by Western blot.Apoptosis rate were determined by TUNEL staining.ResultsBlood glucose,BUN,Scr and PRO in rats from DN group were significantly increased compared with Sham group(P＜0.05),which were attenuated with treatment of Shenshao oral liquid(P＜0.05).HE staining showed that morphological abnormality was observed in DN group including enlarged glomerular volume,inflammatory cell infiltration,glomerular mesangial stromal hyperplasia,tubular basement membrane thickening,and glomerular and tubular fibrosis.Above histopathological deterioration of renal tissue was significantly ameliorated by treatment of Shenshao oral liquid (P＜0.05).Western blot showed that the expression levels of GRP78,PERK and CHOP in renal tissue of DN group were significantly increased when compared with Sham group,which was decreased in SS group.TUNEL staining manifested that increased apoptosis rate in DN group (P＜0.05)in comparison with Sham group could be attenuated in SS group (P＜0.05).ConclusionsShenshao oral liquid reduces development of diabetic nephropathy,restoring renal function in dependence of manipulation on endoplasmic reticulum stress related factors GRP78,PERK,CHOP and apoptosis.

shenshao oral liquid;diabetic nephropathy;endoplasmic reticulum stress;apoptosis

R587.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.005

1005-8982（2017）27-0022-05

2017-04-11

張春來，E-mail：zcl1290@163.com；Tel：15930458965