基于擬糖蛋白的電化學阻抗生物傳感器用于糖與蛋白質(zhì)相互作用的研究

鄒 蕊，黃曉妍

(1.寧夏師范學院 化學化工學院，寧夏 固原 756000；2.固原市原州區(qū)黃鐸堡學校，寧夏 固原 756000)

基于擬糖蛋白的電化學阻抗生物傳感器用于糖與蛋白質(zhì)相互作用的研究

鄒 蕊1*，黃曉妍2

(1.寧夏師范學院 化學化工學院，寧夏 固原 756000；2.固原市原州區(qū)黃鐸堡學校，寧夏 固原 756000)

以D-甘露糖和伴刀豆球蛋白(ConA)的相互作用為研究對象，利用美拉德反應將D-甘露糖共價結合到負載蛋白牛血清蛋白(BSA)的表面形成擬糖蛋白，然后將擬糖蛋白固定到玻碳電極表面，以擬糖蛋白表面的D-甘露糖為分子識別物質(zhì)，構建了檢測伴刀豆球蛋白(ConA)的電化學阻抗傳感器。擬糖蛋白制備過程簡單，D-甘露糖負載量大，在空間中提供多個結合位點，因此能與ConA形成多價復合物，提高了傳感器的靈敏度。該傳感器的響應值與ConA濃度的對數(shù)在5.0×10-11～5.0×10-9mol/L之間呈良好的線性關系，檢出限為1.7×10-11mol/L，D-甘露糖和ConA之間的結合常數(shù)為2.6×106L/mol。該方法簡單，可適用于不同糖和蛋白質(zhì)相互作用的研究，為構建高靈敏度的電化學阻抗傳感器提供了新思路。

電化學阻抗傳感器；糖與蛋白相互作用；擬糖蛋白；伴刀豆球蛋白

糖與蛋白質(zhì)的相互作用在很多生命活動中發(fā)揮著非常重要的作用，如細胞黏附、細胞生長以及免疫反應等[1]。因此，從分子水平上研究糖和蛋白的相互作用可為了解生命活動的復雜過程提供理論依據(jù)，也能夠為醫(yī)療診斷和治療過程提供很大幫助[2-5]。然而糖結合蛋白(如凝集素)均是通過相對較弱的多價作用和糖形成復合物[6]，因此糖基數(shù)目更多、空間構象更立體以及結合位點更豐富的研究方法是糖組學的研究熱點[7]。研究糖和蛋白相互作用的技術有表面等離子體共振(SPR)[8]、石英晶體微天平(QCM)[9]、糖熒光微陣列[4,6,10]、傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法(ELISA)[11]和電化學傳感器[7,12-13]。電化學阻抗(EIS)傳感器通過傳感器與分析物相互作用引起的電極表面電化學阻抗的改變來研究分析物[4-5,14]，無需標記，是一種研究界面生物過程非常有效的技術。

目前，研究糖與蛋白質(zhì)相互作用的電化學傳感器需要將糖固定在電極表面，對糖進行衍生化，在衍生化過程中需進行基團保護，而且衍生化之后的糖在電極表面的固定量較小[15-16]。美拉德反應[17-18]是一種蛋白質(zhì)與還原性糖之間發(fā)生的非酶化學反應，還原性糖的羧基與蛋白質(zhì)肽鏈末端氨基反應生成糖基化席夫堿和水，反應條件非常簡單。蛋白質(zhì)的終端氨基以及側鏈上的賴氨酸和精氨酸[19-20]氨基均能夠發(fā)生反應。在種類繁多的凝集素中，伴刀豆球蛋白ConA是一個研究較多，結構明晰的糖結合蛋白質(zhì)[21-23]，能夠特異性識別D-甘露糖，因此選用ConA為目標分子。本文通過美拉德反應制備了擬糖蛋白，并將其吸附在玻碳電極的表面，以電化學交流阻抗法為檢測技術，構建了非標記、糖負載量大、靈敏度高的電化學交流阻抗傳感器，用于測定糖結合蛋白伴刀豆球蛋白ConA與甘露糖的相互作用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)。玻碳電極(直徑2.0 mm)為工作電極，對電極為鉑絲電極，參比電極為銀/氯化銀電極(Ag/AgCl Sat.KCl)。UV-2450紫外可見分光光度計(日本Shimadzu 公司)記錄紫外可見吸收光譜圖。ALPHA1-2型冷凍干燥機(德國Christ公司)。

伴刀豆球蛋白(Concanavalin A,Mw=104 000 Da,pI=4.5～5.5,蛋白含量約15%)及2-巰基乙醇(C2H6OS,Mw=180.16 )均購自Sigma公司，D-甘露糖(C6H12O6,Mw=180.16)購自國藥試劑公司。牛血清白蛋白(Mw=66 430 Da,pI=4.7)購自科昊生物有限公司。鄰苯二甲醛(簡稱OPA,C8H6O2,Mw=134.13)購于阿拉丁試劑(上海)有限公司，硼砂(Na2B4O7·10H2O,Mw=381.37)以及十二烷基硫酸鈉(簡稱SDS，Mw=288.38)購于西安化學試劑廠。其他試劑均為分析純。實驗用水為超純水(Milli-Q ultrapure，18.2 MΩ·cm)。

伴刀豆球蛋白的活化[22]：伴刀豆球蛋白使用前在100 mmol/L的PBS緩沖溶液(內(nèi)含0.1 mmol/L的Ca2+，Mn2+)中活化6 h。

OPA試劑[17]：將25 mL 0.1 mol/L硼砂，2.5 mL 20%的SDS，100 μL的2-巰基乙醇，40 mg鄰苯二甲醛(先溶于1 mL甲醇中)混合，加入超純水定容至50 mL。OPA試劑需現(xiàn)用現(xiàn)配。

緩沖溶液： 100 mmol/L磷酸緩沖溶液PBS(140 mmol/L NaCl，3.0 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH 7.4)[24]，50 mmol/L碳酸緩沖溶液(6.6 mmol/L Na2CO3，490 mmol/L NaHCO3，pH 9.0)。

檢測溶液：由1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]-1.0 mmol/L K4[Fe(CN)6]緩沖溶液配制而成。

1.2 擬糖蛋白的制備

按照Osuna報道方法進行[17]。取100 mg BSA和30 mg甘露糖加入到4.0 mL 50 mmol/L 的碳酸緩沖溶液(pH=9.0)中，溶液中BSA與甘露糖的摩爾比為1∶60。將混合液于-50 ℃下24 h凍干。然后放置在相對濕度為43%(濕度用飽和K2CO3溶液控制)，溫度為50 ℃的微環(huán)境中20 h后，將產(chǎn)物溶解于5.0 mL水中，然后在超純水中，以14 000 Da的半透膜透析24 h，將產(chǎn)物凍干。此時的產(chǎn)物為BSA與甘露糖反應產(chǎn)物擬糖蛋白。向擬糖蛋白BSA-Man中加入3.0 mL PBS配成儲備液，擬糖蛋白質(zhì)量濃度為33 mg/mL，用時稀釋10倍。

1.3 ConA生物傳感器的制備

傳感器的構建原理如圖1所示，首先通過美拉德反應將D-甘露糖共價結合到負載蛋白質(zhì)-牛血清蛋白BSA上，形成一個擬糖蛋白。而負載在擬糖蛋白上的甘露糖能夠選擇性識別ConA，通過靜電吸附將擬糖蛋白固定到玻碳電極的表面，制成ConA生物傳感器。將生物傳感器浸入ConA溶液中，生物傳感器表面的電子轉移阻抗增加，從而可以定量測定ConA。在構建傳感器過程中，BSA既能將糖固定到電極表面，又能為糖/蛋白質(zhì)的識別提供多價結合的平臺。BSA上共有60個氨基(59個賴氨酸和1個N末端)，其中54個氨基都能夠暴露在蛋白質(zhì)的表面，最近的兩個氨基之間的距離為(11±3)?[25-26]，所以擬糖蛋白BSA-Man上能夠負載大量的D-甘露糖，從而增強了電化學信號，提高了傳感器的靈敏度。

圖1 基于擬糖蛋白的電化學阻抗傳感器組裝原理圖Fig.1 Schematic representation of the EIS sensor based on neoglycoproteins with fabrication and performance steps

傳感器的構建步驟為：先將玻碳電極(直徑2.0 mm)用0.03 μm Al2O3電極拋光粉研磨，再將玻碳電極插入1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]-1.0 mmol/L K4[Fe(CN)6]溶液中，在-0.20～0.60 V下循環(huán)伏安掃描至氧化峰電位與還原峰電位差值ΔEp約80 mV，表明電極表面已處理干凈。在玻碳電極上滴加10 μL 33 mg/mL擬糖蛋白溶液，放置90 min，以PBS沖洗。將不同濃度的ConA滴涂在擬糖蛋白構建的電化學傳感器上，室溫下與ConA結合1 h后進行電化學交流阻抗法檢測。

圖2 傳感器組裝過程中不同電極在1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]-1.0 mmol/L K4[Fe(CN)6]中的復平面阻抗圖Fig.2 Nyquist plots of impedance spectra obtained in 10 mmol/L PBS(pH 7.4) containing 1.0 mmol/L [K3Fe(CN)6]-1.0 mmol/L K4[Fe(CN)6] a.bare GCE，b.neoglycoprotein adsorb onto GCE，c.0.1 nmol/L ConA/neoglycoprotein/GCE， d.1.0 nmol/L ConA/neoglycoprotein/GCE after interaction for 1 h；point line：experimental data,solid line：fitted data;biased potential：0.226 V；frequency：from 0.01 Hz to 100 kHz；amplitude：5.0 mV；insert shows the equivalent circuit applied to fit the impedance spectroscopy

1.4 電化學測量方法

檢測溶液為1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]-1.0 mmol/L K4[Fe(CN)6]。電化學交流阻抗測定時的偏電位為0.226 V，頻率范圍0.01 Hz ～100 kHz，振幅為5.0 mV。采用CHI660軟件擬合等效電路。Ret,0為沒有ConA時的阻抗值，Ret,i為浸入ConA之后的阻抗值。以電子傳遞電阻ΔRet為分析信號，對ConA進行定量測定。采用循環(huán)伏安法表征，電位掃描范圍為-0.20～0.60 V，掃速為50 mV/s。電化學實驗在室溫下(25±1) ℃進行。

2 結果與討論

2.1 生物傳感器的表征

圖2為傳感器制備過程中電極的法拉第阻抗圖，內(nèi)插圖電路中包括電子轉移阻抗(Ret)、界面電容(C)、電解質(zhì)溶液的電阻(Rs)以及Warburg阻抗 (Zw)。由圖可見，實驗所得的阻抗值與CHI660軟件模擬的理論值之間非常一致。說明該等效電路能夠提供一個可行的模型來描述電化學傳感器的性能[24]。

裸玻碳電極的阻抗圖接近于一條直線(曲線a)，阻抗值為0.47 kΩ，當擬糖蛋白吸附到玻碳電極表面2 h后，阻抗值增加到20 kΩ(曲線b)，表明擬糖蛋白吸附在電極表面。將制備好的生物傳感器浸入0.1 nmol/L的ConA中，Ret從28 kΩ增加到43 kΩ(曲線d)，說明ConA與甘露糖之間的特異性相互作用使得ConA連接到傳感器表面，引起阻抗值的進一步增大。ConA的濃度從0.1 nmol/L增加到1.0 nmol/L，Ret值從43 kΩ增加到63 kΩ(曲線e)。ConA的等電點為4.5～5.2，在pH 7.4的溶液中，ConA帶負電，會排斥[Fe(CN)6]3-/4-，因此會引起阻抗值的增大。從實驗現(xiàn)象中可以看出，本研究制作的生物傳感器能夠應用于ConA的檢測。

2.2 擬糖蛋白的紫外可見吸收光譜法表征[17]

BSA與擬糖蛋白中自由氨基的數(shù)量可用鄰苯二甲醛(OPA)法測定。蛋白質(zhì)上的游離氨基能夠與OPA試劑發(fā)生反應，生成物在340 nm處能夠產(chǎn)生一個很強的吸收，因此，OPA試劑能用于蛋白質(zhì)中游離氨基的測定。取100 μL 3.3 mg/mL的BSA或擬糖蛋白加入到1.0 mL的OPA試劑中，室溫下混合2 min，然后在紫外可見光譜儀中測定340 nm處的吸光度。結果顯示，擬糖蛋白與OPA反應2 min后，產(chǎn)物在340 nm處的吸光度下降，游離氨基量減少，說明BSA中的部分氨基與甘露糖發(fā)生了反應。

圖3 阻抗變化值與擬糖蛋白(33 mg/mL)吸附時間的關系Fig. 3 Dependence of ΔRet on the adsorption time of the 33 mg/mL neoglycoprotein on the surface of electrode

2.3 吸附時間的選擇

實驗證明，電化學阻抗生物傳感器能夠?qū)onA產(chǎn)生響應，而電化學響應值與電極表面吸附的擬糖蛋白量之間有密切的關系，隨著吸附時間的增加，電極表面吸附量增大直至達到飽和。因此，對33 mg/mL擬糖蛋白在電極表面的吸附時間進行了考察，以吸附時間與擬糖蛋白修飾電極阻抗值Ret,i和裸玻碳電極Ret,0的差值ΔRet作圖(圖3)。由圖可見，擬糖蛋白吸附時間在30～90 min之間，阻抗值隨吸附時間的增加不斷增大，當結合時間大于90 min后，阻抗值變化趨于穩(wěn)定，說明電極表面吸附的擬糖蛋白已達到飽和。因此，本實驗選擇擬糖蛋白的吸附時間為90 min。

2.4 傳感器與ConA結合常數(shù)的計算

根據(jù)文獻[14-15]報道，電極表面擬糖蛋白與ConA的相互作用可以按照Langmuir吸附模型進行分析。利用電化學阻抗技術，依據(jù)公式(1)和(2)計算傳感器與ConA的結合常數(shù)。

C/ΔR’et=C/ΔR’et,max+1/(ΔR’et,max·Ka)

(1)

ΔR’et=(ΔRet,b-Ret,a)/Ret,a

(2)

圖4 多負載電化學阻抗生物傳感器對不同濃度ConA的復平面阻抗圖Fig.4 Nyquist plots of impedance spectra obtained from different concentrations of ConA on the biosensorconcentration of ConA (a-h)：0，0.5，1.0，2.0，5.0 ，10，20，50(×10-10 mol/L)，respectively

式中，C為ConA的濃度，Ret,a和Ret,b分別為傳感器結合ConA前、后的阻抗值，ΔR’et,max為ConA濃度最大時所計算的ΔR’et值，Ka為傳感器與ConA的結合常數(shù)。結果顯示，在一定的濃度范圍內(nèi)，C/ΔR’et(y)與C(x)呈線性關系，線性方程為y=0.266x+0.025(r2=0.993)。直線在縱軸的截距為1/(ΔR’et,max·Ka)，由此得出傳感器與ConA的結合常數(shù)Ka為2.6×106L/mol。本研究所計算出的結合常數(shù)比文獻報道的ConA與甘露糖單價結合模型所計算的結合常數(shù)大，而與多價結合模型的結合常數(shù)相似，這說明本實驗所制備的電化學阻抗傳感器與ConA是多價結合，結合常數(shù)增大[2,27-30]。

2.5 傳感器的線性范圍

在優(yōu)化的實驗條件下，利用多負載電化學阻抗傳感器對不同濃度的ConA進行測定。圖4為電化學阻抗生物傳感器對不同濃度ConA的復平面阻抗圖，傳感器的響應值與ConA濃度的對數(shù)在5.0×10-11～5.0×10-9mol/L之間呈良好的線性關系(圖4插圖)，線性回歸方程為ΔRet(Ω)=70.83 lgC(nmol/L)+772.23，r2=0.991 1，檢出限(3sb/S)為1.7×10-11mol/L，比已報道的檢出限低[31]。對1.0×10-9mol/L甘露糖分別進行5次平行測定，相對標準偏差(RSD)為3.3%，說明此傳感器具有較好的重現(xiàn)性。

3 結 論

本研究以BSA為負載蛋白質(zhì)，通過美拉德反應將D-甘露糖共價結合到BSA上，生成能夠與ConA特異性結合的擬糖蛋白，然后將擬糖蛋白物理吸附到玻碳電極表面，制備了測定ConA與糖相互作用的電化學阻抗傳感器。結果表明，擬糖蛋白所負載的大量甘露糖能夠和ConA發(fā)生多價結合，增加傳感器的靈敏度。美拉德反應條件溫和，大部分還原性糖都能夠發(fā)生，包括單糖、二糖和多糖。因此，本研究所提出的電化學阻抗生物傳感器新方法可以用于其它糖與蛋白質(zhì)相互作用的研究。

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Investigation on Protein-Carbohydrate Interaction with a Neoglycoprotein Based Electrochemical Impedance Spectroscopy Biosensor

ZOU Rui1*，HUANG Xiao-yan2

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Ningxia Normal University,Guyuan 756000,China；2.Huang-Duo-Bu School of Yuanzhou District of Guyuan,Guyuan 756000,China)

The interaction betweenD-mannose and concanavalin(ConA) was always used as a model target for protein-carbohydrate interactions.A simple,sensitive electrochemical impedance spectroscopy(EIS) biosensor was herein reported for the detection of ConA based on neoglycoproteins.D-mannose was covalently attached to a carrier protein,bovine serum albumin(BSA) to generate multivalent neoglycoproteins by the Maillard reaction.The biosensor was designed by immobilizing the neoglycoproteins on the surface of glassy carbon electrode,whose structures were recognized by concanavalinA(ConA).Since the neoglycoconjugates were easily prepared,a large number ofD-mannoses could format multivalent complexs with ConA.The biosensor was highly sensitive.The increase of the electron transfer resistance of the biosensor was in logarithmically direct proportion to the concentration of ConA in the range of 5.0×10-11-5.0×10-9mol/L.The detection limit for ConA was 1.7×10-11mol/L,with an affinity constantKaof 2.6×106L/mol.The method developed in this study may be a promising approach,and could be extended to the design of an EIS biosensor for highly sensitive and rapid detection of other desired carbohydrate-protein interactions.

EIS biosensor;protein-carbohydrate interactions;neoglycoproteins;ConA

2017-05-31；

2017-07-24

寧夏師范學院重點項目(NX SFZD1602)；六盤山工程中心項目(HG16-06)

*

鄒 蕊，碩士，講師，研究方向：電分析化學，Tel：0954-2079640，E-mail：sfxyzr@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.013

O657

A

1004-4957(2017)11-1370-05