白木香結香樹脂部內生真菌的分離及其結香菌篩選
2017-11-30 19:28:48黃秋偉王麗萍黃顯雅黃惠芳李慧敏
江蘇農業科學 2017年20期
黃秋偉+王麗萍+黃顯雅+黃惠芳+李慧敏
摘要：采用平板培養法對白木香結香部位內生真菌進行分離，以沉香主要成分芐基丙酮作為結香菌的耐藥指標，采用改進的菌塊法進行耐藥能力的篩選。結果表明，從結香部位分離出11株內生真菌，經形態學及分子初步鑒定歸于3目4科5屬，其中在數量上，鐮刀菌屬為優勢種群，其次為木霉屬。經芐基丙酮耐藥篩選發現，鐮刀菌屬的G7耐藥水平較高，對芐基丙酮的劑量變化不敏感，將其選作人工結香菌，效果有所顯現，結香時間大為縮短。
關鍵詞：白木香；內生真菌；芐基丙酮；人工結香
中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0285-05
白木香[ Aquilaria sinensis（Lour.） Gilg]為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）植物，別稱土沉香、女兒香、莞香，為我國特有的珍貴藥用樹種，主產于海南、廣東、廣西等省（區）。其含黑色樹脂的木質部稱為沉香，系《中國藥典》收載的品種，是目前緊缺的名貴藥材和天然香料，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效，主治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥狀[1]。目前，由于白木香的野生資源少，生長周期較長，自然條件下沉香的形成最少也要10年以上的時間，而且并不是所有的白木香都能形成沉香，所以即使通過人工種植白木香，也很難解決天然沉香產量問題，不能滿足市場需求。健康的白木香并不產生樹脂，據目前研究表明，沉香形成機理是健康的白木香樹干在受到損傷或者刺激情況下，其木質部細胞分泌出一種氣味芬芳的防御性黑色樹脂，而這種防御性機制的引發主要與白木香受損后的微生物浸染有很大關系。
內生真菌（Endophytic fungi）是指生活在健康植物的各種組織和器官內部的真菌，被感染的植物不表現明顯的外在病癥，可通過組織學方法，從表面嚴格消毒的植物組織中分離的方法，以及從植物組織內直接擴增微生物DNA 的方法來證明其內生性[2]。對藥用植物內生真菌的研究表明，內生真菌與藥用植物在長期的生活過程中，形成了互惠互利的共生關系，不但可以自身合成與宿主植物相類似活性成分，還具有促進宿主植物合成活性成分的能力。對于促進結香的內生真菌首先在一定程度上對沉香活性成分具有耐受性。沉香的成分比較復雜，主要成分有三大類：倍半萜、2-苯乙基色酮類物和芳香族化合物，芐基丙酮、對甲氧基芐基丙酮是沉香芳香族化合物的代表性成分。近年來，我國珍稀瀕危藥用植物內生真菌及其活性成分的研究成為了藥物開發的熱點，國內外從多種藥用植物內生真菌中篩選出各種生理活性成分陸續見有報道，且發現有一些活性成分具有與宿主植物相同或相似的生理活性[3]。因此，當前國內外研究較多的是關于沉香內生真菌分離及其次生代謝產物活性成分，而對于促進結香的內生菌研究報道仍較少。本研究對已結香的沉香部分進行內生真菌的分離和鑒定，選用芐基丙酮作為試驗條件對分離得到的內生真菌進行結香耐藥性篩選，并通過人工結香試驗，篩選出對白木香結香具有良好促進作用的菌株，為加快天然沉香的結香周期奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 白木香樣品于2014年7月采自廣西壯族自治區靈山縣武利鎮魚良村當地一株樹齡為100年白木香古樹。因古樹比較高大，根系深入地底，所以根部及葉片的組織樣品難以取得，取材部位為莖部的天然結香樹脂部分。白木香樣品采集后于48 h內進行表面消毒。取樣的樹種經中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所鑒定白木香。
1.1.2 主要儀器及試劑 徠卡DM2500型光學顯微鏡；DYY-6C雙穩定時電泳儀；伯樂GEL DOCXR全自動凝膠成像儀；德國Biometra Tprofessional 96梯度PCR儀；LRH-250GB光照恒溫培養箱；日本三洋MLS-3780高壓蒸汽滅菌器；離心柱型真菌基因組DNA提取試劑盒，由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司生產；PCR產物純化及回收試劑盒，由BIOMIGA公司生產；Taq PCR master mix試劑，由上海捷瑞生物工程有限公司生產；芐基丙酮試劑，由Sigma-aldrich公司生產；吐溫80，由北京索萊寶科技有限公司生產。
1.1.3 所用培養基 白木香內生真菌分離培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，硫酸鏈霉素100 mg，氯霉素 100 mg，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0；純化培養基（PDA培養基）；白木香培養基：未結香白木香碎木塊（7年樹齡）100 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0；液體PDA培養基。
上述培養基所用的馬鈴薯與白木香均煮沸30 min后，4層紗布過濾，再補水至1 000 mL，滅菌條件為121 ℃，18 min，硫酸鏈霉素與氯霉素均在培養基冷卻至50～60 ℃時加入。
1.2 試驗方法
1.2.1 內生真菌的分離與純化 內生真菌的分離采用組織塊平板培養法[4-5]，用于分離的白木香天然結香木塊材料采用自來水沖洗1遍，并將腐爛的木質部去除，然后切割成 5 cm×5 cm的木塊，依次用75%乙醇洗1 min，無菌水漂洗1次，5%次氯酸鈉溶液漂洗5 min，無菌水漂洗4次。消毒后的材料置于無菌的干燥濾紙上吸干水分，用無菌手術刀刮去木塊表面組織，并切成1 cm×1 cm的小塊置于分離培養基上，采用三角形法，每個平板放置3個小塊，以最后一次沖洗的無菌水0.1 mL涂板作為陰性對照，來檢驗表面消毒是否徹底。28 ℃恒溫培養直到出現菌落，從菌落邊緣挑取菌絲接種于純化培養基上，經反復轉接純化后的菌株轉接于PDA培養基的試管斜面，于4 ℃冰箱保存備用。
1.2.2 內生真菌的鑒定 形態學鑒定利用肉眼觀察分離菌株在PDA培養基上的培養特征；采用真菌學插片培養法和水滴裝片法，利用光學顯微鏡鏡檢觀察，根據菌落形態特征（包括菌落大小、顏色、表面特征和質地等）和顯微形態特征（包括菌絲和孢子等）參考文獻[6]對白木香結香樹脂部位的分離菌株進行初步鑒定。endprint
分子鑒定先采用液氮研磨，試劑盒提取方法制備真菌總DNA。真菌樣品采取的是菌膜培養法，具體參考陳亮等的研究[7]，從活化好的PDA平板中挑取1接種環菌絲，放入25 mL PDA液體培養基于26 ℃搖瓶培養24 h，充分混勻后，在靜止培養5～7 d形成菌膜，然后挑取菌膜放入研缽，加入液氮并快速研磨成粉末，將粉末分成2份分裝于2.5 mL離心管，一份于-80 ℃保存備用，一份用于DNA提取，提取操作按照試劑盒方法進行。PCR擴增采用真菌rDNA內轉錄間隔區（rDNA ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，正向）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向）擴增分離菌株的rDNA ITS區。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環35次；72 ℃溫育10 min。PCR產物利用BIOMIGA公司生產的純化回收試劑盒純化，純化后的產物由深圳華大基因科技有限公司進行核酸測序。測序結果通過NCBI的BLAST進行序列的同源性檢索比對。
1.2.3 內生真菌的芐基丙酮耐受性篩選試驗 初篩：將保存于試管斜面的菌種轉接于新鮮的PDA培養基中，于26 ℃培養活化以作為供試菌。配制白木香培養基，待培養基冷卻到50～60 ℃，往培養基里滴加0.10%（體積分數，下同）吐溫80作為乳化劑，然后選取體積分數為0.08%加入沉香主要成分之一的芐基丙酮，快速混勻后倒平板。內生真菌對芐基丙酮具有耐受能力的初步篩選采用菌餅法，先用6 mm的打孔器在接有活化好的內生真菌的PDA平板上打出直徑約為6 mm的圓形菌餅，然后用滅菌接種針各挑取1塊圓形菌餅置于含芐基丙酮的白木香培養基平板中央，同時以置于不含芐基丙酮的白木香培養基作為對照，每個處理和對照均設置3次重復，置于26 ℃下恒溫避光培養4 d后，觀察真菌的生長狀況，以菌圈直徑（包括菌餅）作為耐受性指標，計算芐基丙酮對菌絲生長的抑制率，選取對芐基丙酮具有耐受性的菌株進行復篩，生長抑制率的計算公式如下：
菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-6 mm）×100%。
復篩：設置含芐基丙酮0.10%、0.12%、0.14% 3個體積分數梯度的白木香平板，并將具有耐受性的菌株轉接于含藥平板中，轉接方法與初篩試驗中菌餅轉接法一致，置于 26 ℃ 下恒溫避光培養7 d后，觀察真菌的生長狀況，以菌落長勢及菌圈直徑（包括菌餅）作為耐受能力指標，并通過菌絲生長抑制率濃度曲線，選取對芐基丙酮耐受能力較強的菌株作為結香菌。
所有的試驗數據均采用SPSS 19.0統計軟件進行統計，并計算對照組與處理組、處理組與處理組間的顯著性差異。
1.2.4 結香菌人工結香的初步試驗 將篩選出來的菌株轉接到PDA平板上活化，挑取活化后的菌絲（連同培養基）轉接到裝有500 mL液體PDA培養基的1 L三角瓶中，于26 ℃、120 r/min 的條件下搖床培養7 d。液體培養物先后經慢速濾紙及0.45 μm微孔濾膜抽濾，收集濾液，得到菌體發酵液 4 ℃ 備用。選取7～8年樹齡的白木香作為試驗植株，在離地面50 cm處用電鉆打孔，之后將含有發酵液的注射袋的注射頭插入孔隙，吊帶注射一段時間，觀察孔隙口邊緣是否漏液及注射袋是否脹袋，以判別液體是否成功注射入樹體中。接菌注射3個月后，通過觀察注射孔徑位置是否變色，并取其部分材料進行燃燒試驗，觀察其燃燒狀況，來初步判定結香狀況。
2 結果與分析
2.1 白木香樹脂部內生真菌的分離與鑒定結果
本次研究采用組織塊平板分離法，經過多次分離純化后，從白木香的樹脂形成部位分離獲得11株內生真菌，根據PDA平板上的分離次序、形態及培養特征依次進行菌株編號G1、G2，…，G11。經過顯微形態觀察及分子鑒定，將分離得到的內生真菌初步鑒定為3目4科5屬，相關分離結果見表1。分離的5個菌屬依次為鐮刀菌屬、木霉屬、毛色二孢屬、絲孢屬、黏孢屬。其中，鐮刀菌屬有5株，占分離菌株數的45%，為結香部位的優勢菌群；木霉屬有3株，占分離菌株數27%；其余屬各有1株，各占分離菌株數的9%。在觀察鑒定試驗中，鐮刀菌屬與木霉屬培養特征比較明顯。鐮刀菌屬在PDA培養基培養前期產生大量的白色氣生菌絲，并呈現棉絮狀，培養后期不產生色素或者產生黃色、紅色等色素，分生孢子梗主要單生，分生孢子呈鐮刀形或卵圓形；木霉屬在PDA培養基培養前期氣生菌絲為白色，生長密集呈網叢狀，培養后期菌絲轉變為綠色或黃色，分生孢子梗呈二叉狀或三叉狀分枝，分生孢子球形。
2.2 內生真菌耐藥菌的篩選
2.2.1 內生真菌芐基丙酮初篩結果 由表2可知，芐基丙酮對所分離的11株菌均產生了不同程度的抑制作用。從對比差異來看， 鐮刀菌屬的內生真菌有3株的對照組與處理組表現出極顯著性差異；2株的對照組與處理組無明顯差異，分別是G7與G8，說明這2株菌受芐基丙酮的影響較小，耐受能力較為明顯。木霉屬的內生真菌有2株表現出顯著性差異，1株為極顯著差異。其余3個屬的內生真菌均表現極顯著差異。從菌落生長抑制率效果來看，鐮刀菌屬的5株真菌所受抑制率各不相同，抑制率由小到大排列，依次為G7
2.2.2 內生真菌芐基丙酮復篩結果 將初篩得到的4株真菌再次進行復篩試驗，由表3可知，各個菌的對照組與處理組生長情況相差明顯，且總體趨勢是隨著芐基丙酮體積分數提高，抑制生長的效果越明顯。在0.08%芐基丙酮處理中沒有顯著性差異鐮刀菌屬的G7、G8，在體積分數提高到0.10%后，與對照組相比也出現了極顯著性差異。然而，鐮刀菌各個體積分數處理間的菌落生長狀況均沒有明顯差別；木霉屬的各個體積分數處理間均表現出了顯著性差異，甚至有些處理還出現了極顯著性差異，說明這2株木霉屬真菌對芐基丙酮變化量較敏感。此外，由圖2可知，在0.10%、0.12%、014%培養條件下，木霉屬的整體抑制率是低于鐮刀菌屬的，但從抑制率的增長態勢分析，木霉屬增長幅度波動性較大，尤其是體積分數0.14%時，與0.12%抑制率相比，增長幅度達到了約 15.00%，說明木霉屬的G9、G10等2株真菌對于高濃度芐基丙酮耐受能力較低；鐮刀菌屬的增長幅度比較平緩，各個濃度的增長幅度基本維持在2.00%～5.00%，G7各個體積分數增長幅度較為均等，且抑制率水平較其他2株鐮刀菌屬真菌要低一些，說明該菌的芐基丙酮耐受能力水平較高，因此選用G7作為人工接菌結香的結香菌源。
2.3 人工結香試驗初步結果
經發酵液注射過后的白木香樹木，先出現掉葉枯枝的假死現象，后經過一段適應期長出新枝嫩葉。用砍刀將菌種發酵液注射孔及其周圍的表皮去掉后，肉眼觀察發現孔洞周圍的木質部已經發黑變色，變色方向主要是向兩端縱向延伸。變色部分的剖面面積約為1.0 cm×3.5 cm，通過旋轉取樣器深入取樣，深入樹干9.0 cm取出，發現取樣器的頂端帶有小部分白色木質組織，表明變色樹脂的橫向深度約為9.0 cm。將取出的黑色木塊組織肉眼觀察無腐化爛木現象，且經燃燒試驗后無異味黑煙，而是白色帶有淡香的煙氣。初步認為，變色樹脂部分為沉香，所篩選的耐藥菌可以促進結香，圖3為注射菌液后的白木香生長及切面狀況。
3 討論
內生真菌普遍存在于植物中，但不同的植物體內分離到的內生真菌種類和數量有差別，即使是同一種植物，也會因生境、品種和年齡等不同而分離出不同的內生真菌，加上不同的表面消毒程序和分離培養條件及污染控制，也會造成一定的差異。本試驗從白木香的結香樹脂部位分離得到11株真菌，顯示內生真菌多樣性較低。同時，在分離數量上，鐮刀菌屬為結香部位的優勢屬，這些結果與已報道的白木香內生真菌相比較，既有差異又有相似。張秀環等從樹齡為7年的白木香健康部位和樹脂形成部位共分離出42株內生真菌，其中健康部位15株，樹脂形成部位27株，結香部位真菌分布優于健康組織，此外，該研究還發現枝頂孢霉屬為健康部位優勢菌屬，青霉屬為結香部位優勢菌屬[8]。王磊等對不同樹齡白木香和不同的組織部位進行內生真菌的分離鑒定，共分離得到50株真菌，但不同樹齡及組織得到的真菌數量各不相同，從樹齡分布來看，5年樹齡分離數量最多，30年樹齡次之，10月樹齡最少。他們還發現，在不同健康組織（根、莖、葉）和結香組織分離得到的真菌數量上，健康組織33株，結香部位17株，健康組織分布優于結香部位，而分離出來的鐮刀菌全部位于結香樹脂部位，是該部位的優勢種群[9]。造成這種真菌數量種群差異性和結香種群優勢專一性的原因可能是植物不同部位的微環境不同，如化學成分等內在因素，以及種植環境條件外在因素影響了內生真菌的浸染和多樣性。
鐮刀菌屬[10]（Fusarium Link）是重要的菌物類群，是人類發現的重要植物病原菌之一，自然界中兼寄生或腐生生活。該屬真菌可侵染多科植物（茄科、豆科、禾本科、蘭科、松科、錦葵科、藜科、葫蘆科、十字花科、蕓香科和百合科等）引起苗枯、穗腐、根腐、莖腐、穗軸腐爛、冠腐和植物種子、塊莖的腐爛等癥狀[11]。此外，有些鐮刀菌還可直接侵染動物和人類引起嚴重的疾病；有些可分解纖維素、降解有機物，有助于自然界的物質循環；有些可寄生在昆蟲或其他真菌上，作為生防菌被利用；有的在一定培養條件下可產生激素，用于刺激動植物的生長發育[12]。此外，鐮刀菌屬一般的分類鑒定主要是以大小分生孢子形態、培養性狀等形態學特征建立的形態學種，但由于該菌屬會因為其分類性狀易變且不穩定，造成種內分化和顯著差異，這給實際鑒定帶來許多困難。本次試驗分離得到的5株鐮刀菌，相似菌種為腐皮鐮刀菌，但菌落在培養基上面的次生代謝產物（如色素有無及色澤）彼此不同，觀察形態有些有共同特征（如菌落生長大小、孢子著生方式），也有些結構有明顯差異（如孢子大小）和耐芐基丙酮能力的差異，這些可能都是由種內分化造成的。在耐藥性篩選試驗中，看似同種的5株鐮刀菌，各自的耐芐基丙酮能力及抗藥水平均有差異，導致這些差異的發生極有可能是由于種內分化，從而使菌體內的微結構及代謝功能發生改變。對于鐮刀菌的結香效果，一些文獻上也有所報道。例如，Tabata等利用包括三線鐮孢（Fusarium trifosfrium）在內的5種鐮刀菌進人工結香試驗，發現通過接種能產生沉香[13]。Kazzaz等通過對印尼沉香樹的調查研究發現，鐮刀菌（F. laseritum）能促進白木香結香[14]。這些結果都與本次研究結果一致，說明鐮刀菌對于開發白木香的結香技術有著重要作用，尤其是耐芐基丙酮藥性的鐮刀菌。
此外，由于沉香成分復雜，芐基丙酮只是其中的主要成分之一，有些真菌可能不耐芐基丙酮，但會對其他沉香成分有著協同促進作用。本試驗分離得到1株毛色二孢屬真菌，韓曉敏等研究發現的與其同屬的可可毛色二孢菌類發酵液對白木香產生沉香主要成分-倍半萜有著誘導促進作用，而且發酵液產物成分里面也出現了與沉香倍半萜類相一致的成分[15]。因此，筆者認為分離出來的毛色二孢屬也很有可能具備這一誘導作用，并產生倍半萜類化合物，但其本身對芐基丙酮耐受力較差。因此，還須對侵染結香的沉香組織進行物理提取及GC-MS檢測，來分析其內在成分與天然結香的成分差異，以及多個菌屬之間優化搭配，發揮協同作用來促進結香，提高結香品質。endprint
4 結論
本次研究從結香部位分離出11株內生真菌，并從中篩選出1株耐芐基丙酮內生菌，將該菌通過發酵培養后，對白木香進行人工的菌液注射侵染結香，一段時間后得到變色木質組織，經過初步驗證，具備沉香的表觀性質，且形成周期比自然形成時間要短很多，說明所選耐藥菌對促進白木香結香、加快結香時間有良好的效果，因而耐芐基丙酮能力可以作為篩選人工結香菌的重要指標之一，且方法可行。
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