ELISA法診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的虛擬仿真實驗設(shè)計方案

王麗娜　鞠吉雨(通訊作者)　彭美玉　付曉燕　徐靈芝

【中圖分類號】R7 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）11--02

1 臨床案例：

某患，女，23歲，主述“晨僵3月余，伴腕掌關(guān)節(jié)痛2月余”。患者3個月前無明顯誘因出現(xiàn)晨僵，每次持續(xù)時間在2小時左右，后自行緩解。2個月前出現(xiàn)腕、掌指關(guān)節(jié)痛。

查體：腕關(guān)節(jié)，近端指關(guān)節(jié)壓痛，雙側(cè)指關(guān)節(jié)對稱性關(guān)節(jié)腫，右手掌指關(guān)節(jié)處見皮下結(jié)節(jié)，余無特殊。

免疫學(xué)檢查：IgG15.3g/L、IgA4470mg/L、IgM3640mg/L、C30.98g/L、C40.24g/L、RF360IU/ml、ANA（-）、Anti-dsDNA（-）、ENA（-）、AKA（+）、CCP（+）CRP116mg/L、AAG829mg/L。

2 ELISA簡介：

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），其基本原理是：利用標(biāo)記技術(shù)將酶標(biāo)記到抗體或抗原上，然后將其與待檢物中相應(yīng)的抗原或抗體與酶標(biāo)記抗體或抗原發(fā)生特異性反應(yīng)。在遇到相應(yīng)的酶底物時，酶能高效、專一催化底物，生成帶顏色的產(chǎn)物。借助反應(yīng)體系的顏色變化及呈色深淺，待檢物中有無特異的抗原或抗體及其含量。

該方法可對待檢樣品進(jìn)行定性和定量分析；同時具有微量、高效、特異、經(jīng)濟(jì)、方便的特點，因此是一種廣泛應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的微量檢測技術(shù)。應(yīng)用ELISA技術(shù)進(jìn)行測定的方法很多，根據(jù)檢測目的和操作步驟的不同，通常有三種類型的檢測方法。

（1）間接法：主要用于檢測抗體。此法是檢測抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體上，加入待測血清（抗體）與之結(jié)合，洗滌后，加酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測定。

（2）雙抗體夾心法：此法常用于檢測抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加入待測標(biāo)本（含相應(yīng)抗原）與之結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體及底物溶液進(jìn)行測定。

（3）抗原競爭法：此法主要用于抗原及半抗原的定量測定。小分子抗原或半抗原因如小分子激素、藥物等，由于缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。以測定抗原為例，將待檢標(biāo)本中（即待檢抗原）和一定量的抗體結(jié)合，隨后將抗原抗體反應(yīng)的混合物加入已包被抗原的固相載體上，洗滌后加入酶標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，原理與間接ELISA相似。由于只有游離的抗體能夠和已知的抗原結(jié)合，因此標(biāo)本中的抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，最后的顯色也愈淺，反之，結(jié)合于固相的抗體越多，說明待檢樣本中的抗原越少，顯色就越深，即最后的顯色反應(yīng)與待測抗原含量呈負(fù)相關(guān)。

3 實驗?zāi)康?/p>

通過案例，引出ELISA在疾病免疫學(xué)診斷中的應(yīng)用；通過虛擬實驗操作讓學(xué)生熟悉ELISA的原理，操作步驟，常用試劑及實驗設(shè)備，實驗注意事項等，以及ELISA實驗中用到的相關(guān)抗體的特點及抗原抗體結(jié)合等知識點。拓寬學(xué)生的知識面，引導(dǎo)學(xué)生理論聯(lián)系實際，理論聯(lián)系臨床。

4 實驗設(shè)計：

4.1 通過類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的案例，引入ELISA在該病免疫學(xué)診斷中的應(yīng)用。引導(dǎo)學(xué)生查閱有關(guān)ELISA相關(guān)資料，如ELISA的原理，方法和用途等，學(xué)生也可以點擊預(yù)習(xí)按鈕預(yù)習(xí)我們提供的有關(guān)ELISA的理論，為后續(xù)的實驗打好基礎(chǔ)。

4.2 通過問題的提出，引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行虛擬實驗操作，問題如下：

4.2.1 免疫學(xué)檢查類風(fēng)濕因子RF含量常用什么方法，如何操作？

有間接法和雙抗體夾心法兩種方法可選，讓學(xué)生先選擇方法，選擇正確后可以點擊繼續(xù)按鈕，繼續(xù)后續(xù)實驗步驟的操作。

雙抗體夾心ELISA法檢側(cè)IgGRF實驗步驟：.

①包被：每孔100ul兔IgG（100ng/ml，包被液為碳酸鹽緩沖液pH9.6），4℃過夜，室溫封閉1h（封閉液PBS+0.5%Tween20+10%小牛血清）。

②每孔100ul1：100稀釋待測血清，37℃溫箱孵育2h。

③每孔加100ul兔抗人IgG-HRP（1：1000稀釋），37℃溫箱孵育2h

④ABTS（稀釋液為檸檬酸）15min顯色，410nm波長讀OD。

每一步均用PBS+0.5%Tween20洗滌三遍，每板有陽性對照和陰性對照。

3.2.2 免疫學(xué)檢測抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）常用什么方法，如何操作？

有間接法和雙抗體夾心法兩種方法可選，讓學(xué)生先選擇方法，選擇正確后可以點擊繼續(xù)按鈕，繼續(xù)后續(xù)實驗步驟的操作。

間接ELISA檢測抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的實驗步驟：

①用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原。

②往包被抗原的微孔中加入100ul待測血清，37℃溫箱孵育45分鐘。

③每孔加入100ulHRP標(biāo)記的抗人IgG抗體，37℃溫箱孵育30分鐘。形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。

④加100ul底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（Anti-CCP）呈正相關(guān)。

⑤用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（Anti-CCP）濃度。

每一步均用PBS+0.5%Tween20洗滌三遍，每板有陽性對照和陰性對照。3.2.3在檢測抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP）的實驗中，酶標(biāo)二抗有多種選擇，比如用酶標(biāo)羊抗鼠IgG抗體，酶標(biāo)羊抗人IgG抗體，酶標(biāo)羊抗兔IgG抗體，酶標(biāo)羊抗馬IgG抗體，要選擇哪一種，為什么？

注：實驗步驟中加下劃線的部分是學(xué)生需要選擇的正確答案，需要把相應(yīng)的正確答案點選到相應(yīng)的步驟中實驗才能繼續(xù)進(jìn)行，才能得分，選錯不得分。

5 虛擬實驗操作

5.1 虛擬實驗所需器材及試劑：類風(fēng)濕因子ELISA檢測試劑盒，抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測試劑盒。洗滌液（PBS）、酶底物、終止液，濾紙，溫箱，廢液缸，加樣器，濕盒，酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀

5.2 虛擬實驗場景：實驗室操作臺

5.3 虛擬實驗結(jié)果：陽性孔加底物后顯色，陰性對照孔不顯色。

5.4 虛擬實驗注意事項：洗滌要徹底，底物要先用現(xiàn)配，避光顯色。

5.5 虛擬實驗計分系統(tǒng)：每個選項選錯不得分，選對一個得一分。

5.6 虛擬實驗相關(guān)知識：抗原抗體反應(yīng)的原理和特點；抗體的特性；ELISA的基本原理，方法，結(jié)果判斷和用途。

參考文獻(xiàn)

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王玉輝，幾種免疫學(xué)指標(biāo)聯(lián)合檢測在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷中的價值，中國民康醫(yī).學(xué)，2010，22（14）：1769-1769

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