無機砷影響蛋白核小球藻光合活性的特征研究

許荔萍，周昉，馮寧，張建英*

(1. 浙江大學 環境與資源學院， 浙江 杭州 310058； 2. 杭州市環境保護科學研究院， 浙江 杭州 310014)

無機砷影響蛋白核小球藻光合活性的特征研究

許荔萍1，周昉1，馮寧2，張建英1*

(1. 浙江大學 環境與資源學院， 浙江 杭州 310058； 2. 杭州市環境保護科學研究院， 浙江 杭州 310014)

采用蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)進行無機砷毒性暴露實驗，分析As(III)和As(V)對蛋白核小球藻光合活性的影響差異.結果表明： 該藻對無機砷具有較強的耐受性，在砷濃度大于37.5 mg·L-1暴露條件下，小球藻葉綠素a合成、光系統II(PSII)最大光量子產量(Fv/Fm)、實際光量子產量(Yield)及相關參數與無機砷濃度呈顯著負相關，As(III)對小球藻光合活性抑制作用顯著高于As(V).As(III)和As(V) 150.0 mg·L-1暴露96 h對小球藻光系統II影響差異最大，Fv/Fm、Yield、rETRmax和線性斜率(α)分別降低了77%，91%，92%，85%和19%，50%，51%，23%.透射電鏡進一步表明，小球藻亞細胞結構形態受砷脅迫出現葉綠體片層間空泡化、類囊體基粒片層受擠壓、蛋白核縮小及脂質滴.As(III)對蛋白核小球藻光系統II (PSII)抑制作用大于As(V),可為深入了解無機砷對淡水微藻光合活性的影響機理提供一定的參考.

無機砷；蛋白核小球藻；葉綠素熒光；透射電鏡

砷是自然環境中普遍存在的有毒類金屬，水體中無機砷主要以三價砷As(III)和五價砷As(V)形態存在[1].近年來，含砷殺蟲劑、除草劑的使用，化石燃料的燃燒以及含砷礦產的大量開采等人類活動導致水體砷濃度日益增大[2]，砷污染較為嚴重的國家主要分布于亞洲，以孟加拉、中國、印度最為典型[3].砷的毒性研究已涉及多種水生生物，如無脊椎動物和海洋浮游植物等[4]，淡水微藻作為水體重要的初級生產者，砷污染下其生長及光合活性等重要生命活動均受到影響.已有研究表明，銅綠微囊藻在10 mg·L-1As(III)脅迫下，其葉綠素a的合成和光系統II (PSII)受到了顯著抑制[5].一般而言，As(III)對動物及海洋浮游植物的毒性大于As(V)[6-7]，然而，As(III)和As(V)對淡水微藻的毒性大小仍存在爭議.如BAHAR等[8]研究表明，As(III)對淡水小球藻(Chlorellasp)96 h EC50為111.8 (105.5～118.4) mg·L-1，顯著高于As(V) 8.33 (6.99～9.24) mg·L-1，As(V)的毒性大于As(III).光合作用是微藻最基本、最重要的生理生態特征，光合作用中光能吸收、傳遞及轉化是由位于光合膜上具有特定分子排列的色素蛋白復合體系光系統I (PSI)和光系統II (PSII)所推動[9].PSII在光反應過程中激發高能電子、分解水分子、釋放氧和推動電子傳遞，對啟動第1步光反應非常重要[10]，葉綠素熒光技術能夠快速反映藻的PSII光化學變化[11].

為探討不同價態砷As(III)和As(V)對淡水微藻光系統II (PSII)影響的差異，本研究以生態毒理實驗中常用的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)為實驗對象[12-13]，應用葉綠素熒光技術研究了As(III)和As(V)對蛋白核小球藻光系統II (PSII)的影響，比較不同價態砷As(III)和As(V)對小球藻光系統II (PSII)最大光量子產量(Fv/Fm)、實際光化學量子產量(Yield)及相關參數的影響，從而揭示As(III)和As(V)對小球藻光合活性的影響差異；再結合透射電鏡來表征As(III)和As(V)對蛋白核小球藻亞細胞器的損傷特征，從光系統II (PSII)和超微觀形態變化2個層面揭示蛋白核小球藻對As(III)和As(V)的應迫機理.

1 材料與方法

1.1 藻種及培養條件

蛋白核小球藻(FACHB-9)購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫.藻種采用BG11培養基置于光照培養箱，培養溫度設為25 ℃、光照強度4 000 lx、光暗周期比14 h∶10 h、搖床轉速120 r·min-1.藻種初始細胞密度約為106cells·L-1，培養時長5 d，每組設定3個平行樣，并以不加砷藻液為空白對照.

1.2 實驗設計

取對數期蛋白核小球藻進行實驗，初始細胞密度約為106cells·L-1，As(III)濃度梯度設為15.0，37.5，75.0，112.5，150.0和225.0 mg·L-1，As(V)濃度梯度設為15.0，37.5，112.5，150.0，225.0和375.0 mg·L-1，每組設置3個平行樣，并以不加砷的藻液作為空白對照，培養時長5 d，每隔24 h取樣，用分光光度計UV-2450測定小球藻的光密度.選取37.5，112.5及150.0 mg·L-1濃度對小球藻進行無機砷毒性暴露，時長5 d，并設置空白對照，每隔24 h定時取樣，用葉綠素熒光儀測定小球藻的葉綠素a含量及葉綠素熒光參數.

1.3 實驗方法

1.3.1 小球藻細胞生長測定

蛋白核小球藻細胞密度(Y×106cell·mL-1)與吸光值OD690(X)之間具有很好的線性關系，可得線性回歸方程為Y=16.127X-0.18 (R2>0.999).因此其生長狀況采用分光光度計UV-2450測得的光密度值 (OD690)進行表征；同時根據細胞生長狀況計算砷對小球藻的生長抑制率η.

μ=[ln(Nn)-ln(N0)] / (tn-t0)，

η=(μ0-μs)/μ0×100%，

式中，N0和Nn分別為起始時間(t0)和毒性測試時間(tn)的藻密度，μ0與μs分別為空白組與處理組的生長率.

1.3.2 葉綠素a及葉綠素熒光參數測定

通過葉綠素熒光儀(PHYTO-PAM，Walz，Germany)測定藻類初始光合活性、空白組(不添加砷)以及砷暴露24，48，72，96和120 h后的光合作用活性.取2 mL藻樣，暗反應5 min后，先打開測量光(measuring light, ML)儀器檢測最小熒光F0，隨后打開飽和脈沖(saturation pluse, SP)，得到最大熒光Fm，(Fm-F0) 即為可變熒光Fv，Fv與Fm的比值(Fv/Fm)，即為光系統II的最大光量子產量(Fv/Fm)[14].將儀器設定為每隔20 s強度逐漸增大的光化光(actinic light, AL)，得到快速光響應曲線(rapid light curve, RLC)，利用PHYTO-PAM分析軟件v2.13可直接讀取光響應曲線特征參數： 最大電子傳遞速率(rETRmax)、線性區段斜率α[15].在光適應180 s后，打開飽和脈沖測定蛋白核小球藻的實際光化學量子產量(Yield).在光頻率為32 Hz時測得即時熒光(Ft)與葉綠素a濃度呈線性關系，因此可得藻葉綠素a含量[14].

1.3.3 亞細胞形態學分析

取20 mL藻液3 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，將藻泥收集于1.5 mL離心管，加入2.5%的戊二醛溶液，4 ℃固定過夜，然后按下列步驟處理樣品[16]：

(1) 3 500 r·min-1離心10 min,棄固定液，用2%瓊脂凝固5 min，加0.1 mol·L-1，pH值為 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min；再用1%的鋨酸溶液固定樣品1.5 h；固定結束后，用0.1 mol·L-1，pH 值為7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min；

(2) 用梯度濃度(包括30%，50%，70%，80%，90%和95% 6種濃度)的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種濃度處理15 min，再用100%的乙醇處理20 min；最后過度到純丙酮處理20 min；脫水后的樣品用V/V=1/1包埋劑與丙酮的混合液處理1 h；再用V/V=3/1包埋劑與丙酮的混合液處理樣品3 h；最后將樣品浸沒于純包埋劑中處理過夜；

(3) 將經過滲透處理的樣品包埋起來，70 ℃加熱過夜.包埋好的樣品在Reichert超薄切片機中切片，獲得70～90 nm的切片，該切片經檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15 min后，在Hitachi H-7650型透射電鏡中觀察.

1.4 數據統計分析

用SPSS 20軟件(IBM)進行數據分析，3次重復實驗結果均以平均值±標準偏差(mean±SD)表示.砷毒性劑量-效應采用Probit回歸分析求得；暴露組與空白組差異顯著性分析由one-way ANOVA方差分析法和最小顯著極差法(LSD)完成.葉綠素熒光快速光曲線數據由PhytoWin軟件直接讀出，其參數由PhytoWin軟件經Platt擬合給出.

2 結果與討論

2.1 As(III)與As(V)對小球藻的劑量效應特征

不同砷暴露濃度下小球藻的生長曲線表明，砷濃度低于37.5 mg·L-1時，蛋白核小球藻對砷毒性表現出一定的耐受性，而當砷濃度高于75.0 mg·L-1時，會顯著抑制小球藻的生長，且隨著砷暴露濃度的增大，其抑制作用增強(見圖1和圖2).用SPSS Probit回歸分析獲得48，72，96及120 h暴露時間下，As(III)對該藻的EC50值分別為 174.7，111.0，93.7及87.7 mg·L-1均顯著低于As(V)的EC50值213.0，159.0，150.7及144.7 mg·L-1(p<0.01)(見表1)，表明同等條件下As(III)對蛋白核小球藻的毒性顯著大于As(V).

表1 As(III)與As(V)對蛋白核小球藻的EC50值

圖1 As(III)對蛋白核小球藻生長的影響Fig.1 Effects of As(III) on the growth of C. pyrenoidosa

圖2 As(V)對蛋白核小球藻生長的影響Fig.2 Effects of As(V) on the growth of C. pyrenoidosa

2.2 小球藻葉綠素a對不同價態砷的響應差異

由表2可知，在37.5 mg·L-1砷暴露下，藻內葉綠素a合成未受到抑制；而高砷脅迫下，藻內葉綠素a含量顯著低于空白組，且葉綠素a對As(III)濃度的變化更為敏感.37.5 mg·L-1As(III)暴露48～96 h后，葉綠素a含量顯著高于空白組(p<0.05)，這與37.5 mg·L-1As(III)刺激蛋白核小球藻的生長實驗結果相一致.當砷濃度高于112.5 mg·L-1時，As(III)與As(V)對小球藻葉綠素a合成的抑制作用存在顯著性差異(p<0.01)，相同濃度下As(III)對葉綠素a的合成抑制更為顯著.在150.0 mg·L-1As(V)和As(III)暴露48，72，96 h后，胞內葉綠素a分別降低了17% (p<0.01)，27% (p<0.01)，46% (p<0.01)和30% (p<0.01)，64% (p<0.01)，71% (p<0.01).綜上所述，葉綠素a對 As(III)和As(V)的暴露響應規律與As(III)和As(V)對小球藻生長的影響一致，均表現為高濃度As(III)對該藻的生長抑制作用大于As(V).

表2 As(III)與As(V)對蛋白核小球藻葉綠素a的影響

Table 2 Effects of different concentrations of As(III) and As(V) on the chlorophyll a content ofC.pyrenoidosa

砷濃度/(mg·L-1)48hChla/(mg·L-1)As(III)As(V) 72hChla/(mg·L-1)As(III)As(V) 96hChla/(mg·L-1)As(III)As(V)0．01．15±0．051．96±0．052．85±0．1137．5+(1．24±0．08)?+(1．16±0．11)+(2．01±0．15)?+(1．98±0．16)+(3．08±0．33)?+(2．88±0．29)112．5-(0．92±0．06)??-(1．03±0．03)??#-(1．06±0．09)??-(1．59±0．06)??##-(1．19±0．04)??-(2．24±0．24)??##抑制率/%201046195821150．0-(0．81±0．01)??-(0．96±0．06)??#-(0．70±0．01)??-(1．43±0．05)??##-(0．83±0．05)??-(1．54±0．08)??##抑制率/%301764277146

*p<0.05,**p<0.01, 分別表示暴露組與空白組有統計學上的差異與顯著差異，#p<0.05,##p<0.01, 分別表示As (III)與As(V)有統計學上的差異與顯著差異, +、-分別表示促進和抑制作用.

2.3 As(III)與As(V)抑制小球藻光合活性的差異

由圖3可知，無機砷濃度為150.0 mg·L-1時，蛋白核小球藻最大光量子產量(Fv/Fm)及最大電子傳遞速率(rETRmax)等葉綠素熒光參數均顯著低于空白組(p<0.01)，且隨著暴露時間的延長整體呈下降趨勢.150.0 mg·L-1As(III) 和As(V)暴露96 h對小球藻PSII影響差異最大，最大光量子產量(Fv/Fm)分別降低了77% (p<0.01)和19% (p<0.01)，實際光化學量子產量(Yield)分別降低了91% (p<0.01)和50%(p<0.01)，線性區段斜率(α)分別降低了85% (p<0.01)和23% (p<0.01)，最大電子傳遞速率(rETRmax)分別降低了92% (p<0.01)和51% (p<0.01)(見圖3)，說明As(III)對小球藻PSII抑制作用顯著高于As(V) (p<0.01).

最大光量子產量(Fv/Fm)代表的是暗適應條件下光系統II(PSII)中能夠將吸收的光能轉化為光化學能量的反應中心的比例，體現了最大光合潛能[17].當小球藻處于光化光條件時，質體醌A (QA)通過質體醌B (QB)、質體醌 (PQ)和光系統I (PSI)不斷向煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸 (NADP+)傳遞電子，電子最終傳遞給CO2，因此質體醌A (QA)始終保持氧化狀態，最大光量子產量(Fv/Fm)值較高[18].而當小球藻受到砷脅迫時，光系統II和光系統I之間的電子傳遞受阻，質體醌A氧化還原反應受到限制，此時最大光量子產量(Fv/Fm)會降低.由圖3(a)可知，砷濃度為150.0 mg·L-1時，As(III)對小球藻PSII最大光量子產量(Fv/Fm)的抑制作用極顯著高于As(V) (p<0.01)，說明As(III)對PSII電子傳遞抑制更強.圖3(d)進一步證實了As(III)對小球藻電子傳遞的抑制作用更大.由于光合磷酸化與光合電子傳遞相偶聯[19]，所以砷能抑制蛋白核小球藻光系統II上的醌 (Q)向質體醌 (PQ)的電子傳遞，從而抑制小球藻的光合活性.綜上，As(III)暴露下小球藻PSII電子傳遞受阻更為嚴重，從而降低了藻的光化學量子效率，抑制了蛋白核小球藻的光合作用活性.

2.4 As(III)與As(V)對小球藻亞細胞結構的影響

圖4(a)顯示了正常蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)的亞細胞結構，蛋白核小球藻由細胞壁(cell wall, CW)包裹，葉綠體(chloroplast, C)呈葉片狀位于細胞周邊，幾乎占據整個細胞，類囊體(thylakoid, T)呈片層狀條理分布于葉綠體中，蛋白核(pyrenoid, P)周圍由一圈分布均勻的淀粉顆粒(starch grain, S)包圍著.與空白組相比，225.0 mg·L-1As(III)與As(V)處理48 h后，藻細胞類囊體結構因受到擠壓凌亂地分布于葉綠體中，并出現了脂質滴 (lipid droplets, Ld)(見圖4(b)、(c)).由于類囊體是葉綠體中執行光能吸收和轉化的場所，光合膜擠壓受損將抑制光合電子的傳遞，抑制光合作用，從而阻礙細胞生長.與As(V)處理組相比，As(III)處理后葉綠體片層之間空泡狀結構更為嚴重，類囊體基粒片層受擠壓程度明顯高于As(V)(見圖4(b)、4(c))，進一步證實了As(III)對小球藻光合損傷作用顯著大于As(V).

3 結 論

通過研究As(III) 和As(V)對蛋白核小球藻光系統II (PSII)的影響及差異，并觀察了As(III)和As(V)對小球藻葉綠體光合膜造成的損傷，揭示了As(III)對小球藻光系統II (PSII)的抑制作用大于As(V).150.0 mg·L-1As(III) 和As(V)暴露96 h對小球藻PSII影響差異最大，最大光量子產量(Fv/Fm)、實際光量子產量(Yield)、最大電子傳遞速率(rETRmax) 和線性斜率(α)前者分別降低了77%，91%，92%，85%，后者分別降低了19%，50%，51%，23%.高濃度無機砷脅迫下蛋白核小球藻葉綠體片出現了層間空泡化、淀粉粒增多、蛋白核縮小、脂質滴等現象，且As(III)脅迫下小球藻類囊體受損程度高于As(V).本研究從光合電子傳遞和亞細胞結構形態特征層面，揭示了As(III)對蛋白核小球藻光合活性的抑制作用要大于As(V)，豐富了不同價態As(III)和As(V)對淡水微藻毒效應的研究.

圖3 As(III)與As(V)對蛋白核小球藻葉綠素熒光參數的影響Fig.3 Effects of different concentrations of As(III) and As(V) on the chlorophyll fluorescence parameters of C. pyrenoidosa

圖4 蛋白核小球藻處理48 h后的亞細胞結構TEM圖Fig.4 TEM images of subcellular structure of C. pyrenoidosa treated for 48 h

放大倍數： 左列×30 000，右列×50 000；圖中，CW—細胞壁，C—葉綠體，T—類囊體，P—蛋白核，S—淀粉顆粒，Ld—脂質滴，N—細胞核，V—液泡.

Magnification ： left column×30 000，right column×50 000; CW—cell wall, C—chloroplast, T—thylakoid, P—pyrenoid, S—starch grain, Ld—lipid droplets, N—nucleus, V—vacuole.

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XU Liping1, ZHOU Fang1, FENG Ning2, ZHANG Jianying1

(1.InstituteofEnvironmentalScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China; 2.HangzhouInstituteofEnvironmentalScience,Hangzhou310014,China)

InfluenceofinorganicarseniconphotosyntheticactivityofChlorellapyrenoidosa.Journal of Zhejiang University(Science Edition),2017，44(6)： 675-681

The arsenic contamination in aquatic environment has drawn significant attention to ecotoxic risk. The valence states of arsenic including arsenite [As(III)] and arsenate [As(V)] play an important role for their behavior and toxicity at different levels of exposure concentrations. In this study, the toxicity of different concentrations of As(III) and As(V) toChlorellapyrenoidosawas determined and compared based on four different test endpoints： The growth inhibition rate, the chlorophyll a (Chl a) concentration, the chlorophyll fluorescence parameters of photosystem II (PSII) and the ultra-structural morphology of cells. The EC50values of As(V) were higher than As(III), which indicated that As(III) was more toxic toC.pyrenoidosathan As(V). The Chl a concentration ofC.pyrenoidosatreated by As(V) was higher than that treated by As(III). In general, the chlorophyll fluorescence parameters including the maximum quantum yields (Fv/Fm), the effective quantum yields (Yield), the maximum electron transport rate (rETRmax) and the linear section slope (α) ofC.pyrenoidosatreated by 150.0 mg·L-1As(III) for 96 h were decreased by 77%, 91%, 92% and 85%, which was higher than that exposed to As(V) of 19%, 50%, 51% and 23%, respectively, and chlorophyll fluorescence parameters were inhibited by high concentrations of both arsenic. The ultrastructural morphology of cells grown in the two species arsenic was observed by transmission electron microscopy. The cell wall separated from the cell membrane, accumulated starch granules were observed in the chloroplast, and diminishing pyrenoid and some lipid droplets were also observed in the cytoplasm. The mechanism of arsenite and arsenate toxicity toC.pyrenoidosawas explored, and the inhibition of PSII photosynthetic efficiency toC.pyrenoidosawas determined. These results will help to develop an understanding of the biologically mediated environmental processes of arsenite and arsenate.

inorganic Arsenic;Chlorellapyrenoidosa; chlorophyll fluorescence; transmission electron microscopy

2017-03-31.

國家自然科學基金資助項目(21477103).

許荔萍(1990—)，ORCID: http://orcid.org/0000-0002-2855-422X，女，碩士，主要從事水生態毒理學研究，E-mail:21314017@zju.edu.cn.

*通信作者，ORCID: http://orcid.org/0000-0002-1636-5544，E-mail：zjy@zju.edu.cn.

10.3785/j.issn.1008-9497.2017.06.006

X 172

A

1008-9497(2017)06-675-07