尖銳濕疣患者外周血Treg/Th17細(xì)胞平衡及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

陳 華，熊 琦，陳永艷

(1 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000； 2 重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院，重慶 綦江 401420)

·論著·

尖銳濕疣患者外周血Treg/Th17細(xì)胞平衡及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

陳 華1,2，熊 琦1，陳永艷1

(1 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000； 2 重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院，重慶 綦江 401420)

目的探討Treg/Th17細(xì)胞失衡在尖銳濕疣(CA)發(fā)病及復(fù)發(fā)機(jī)制中的作用及意義。方法選取52例CA患者(初發(fā)27例，復(fù)發(fā)25例)作為研究組，30例健康者為正常對照組，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測其外周血Treg、Th17細(xì)胞的比例，實時熒光定量PCR檢測外周血單個核細(xì)胞中Foxp3 mRNA和RORγt mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果CA患者外周血Treg細(xì)胞比例、Foxp3 mRNA表達(dá)水平高于正常對照組，復(fù)發(fā)組高于初發(fā)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；Th17細(xì)胞比例、RORγt mRNA表達(dá)水平低于正常對照組，復(fù)發(fā)組Th17細(xì)胞比例低于初發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；Treg/Th17比值高于正常對照組[4.60(3.20,8.68) vs 1.39(1.05，2.05)]，復(fù)發(fā)組高于初發(fā)組[8.19(4.21,10.81) vs 3.52(2.47，4.85)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論CA患者存在Treg/Th17細(xì)胞失衡，復(fù)發(fā)患者Treg/Th17細(xì)胞失衡更顯著，并可能在CA發(fā)病及復(fù)發(fā)機(jī)制中起重要作用。

尖銳濕疣； Foxp3； RORγt； Treg； Th17； Treg/Th17

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是由人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染所致的性傳播疾病，傳染性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高[1-2]，目前發(fā)病及復(fù)發(fā)機(jī)制尚不完全清楚。有資料[3-4]表明，CA的發(fā)生、遷延不愈、頑固難治及多次復(fù)發(fā)與機(jī)體的細(xì)胞免疫功能低下有關(guān)。既往研究[5-6]表明，CA患者存在Th1/Th2失衡，導(dǎo)致機(jī)體不能完全清除HPV，是促進(jìn)CA多次復(fù)發(fā)的重要因素之一。但Th1/Th2失衡不能完全闡明CA的免疫發(fā)病機(jī)制，推測CD4+T細(xì)胞中存在一些新的細(xì)胞亞群也可能與CA的發(fā)病有關(guān)。近年來，隨著對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cell,Treg)、輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17, Th17)兩類新的CD4+T細(xì)胞的深入研究，有文獻(xiàn)報道Treg/Th17細(xì)胞平衡的異常在感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[7-8]。CA患者是否也存在Treg/Th17細(xì)胞平衡的偏移，目前研究較少。本研究通過檢測初發(fā)和復(fù)發(fā)CA患者外周血Treg和Th17細(xì)胞的比例，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和RORγt mRNA的表達(dá)水平，探討Treg/Th17細(xì)胞失衡在CA發(fā)病及復(fù)發(fā)機(jī)制中的作用及意義，為CA的免疫治療提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2015年11月—2016年6月在本院皮膚性病門診就診，符合CA診斷標(biāo)準(zhǔn)患者52例[9]，男性30例，女性22例，年齡15～74歲，平均年齡(33.9±13.5)歲，進(jìn)一步分為初發(fā)組和復(fù)發(fā)組。CA初發(fā)組27例：首次就診并符合CA診斷者，均未經(jīng)過治療，男性17例，女性10例，平均年齡(36.3±14.5)歲；CA復(fù)發(fā)組25例：既往診斷CA，經(jīng)治療后3個月內(nèi)復(fù)查，在原發(fā)皮損處或鄰近部位出現(xiàn)新發(fā)疣體者，男性13例， 女性12例，平均年齡(31.4±12.1)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有自身免疫性疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病、感染性疾病及1個月內(nèi)使用過免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑及抗菌藥物的患者，以及妊娠婦女。選擇同期本院的健康體檢者30例作為對照組，其中男性17例，女性13例，平均年齡(30.6±8.7)歲，各組的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。本研究遵循倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有受試者均在知情同意的情況下留取標(biāo)本。

1.3 實驗方法

1.3.2 實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR) 檢測外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中Foxp3、RORγt mRNA的表達(dá)水平：抽取外周靜脈血5 mL，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞。Trizol一步法提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。按照試劑盒說明書合成cDNA操作，并以此模板進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。Real-time PCR特異性引物均由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計并合成。內(nèi)參基因β-actin上游：5′-ACAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游：5′-CATGCCGGAGCCGTTGTCGAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度101 bp；目的基因Foxp3上游：5′-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3′，下游：5′-TCTCTCTGCCTCAGCCTTGCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度184 bp。目的基因RORγt上游：5′-CTGCTGAGAAGGACAGGGAGCCAA-3′，下游：5′-AGGAGTAGGCCGCGTTACAGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度184 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃ 15 min；85℃ 5 s，完成cDNA合成。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性 5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后應(yīng)用系統(tǒng)軟件繪制擴(kuò)增曲線、熔解曲線。用2-△△Ct法計算相對表達(dá)量，ΔCt=Ct(目的)-Ct(內(nèi)參)。

2 結(jié)果

2.1 外周血Treg、Th17細(xì)胞的比例 CA組患者外周血Treg細(xì)胞比例高于正常對照組，Th17細(xì)胞比例低于正常對照組，Treg/Th17細(xì)胞比值高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.38,P<0.001;t=3.383,P=0.001;Z=-5.425,P<0.001)。CA 患者不同組比較：CA復(fù)發(fā)組Treg細(xì)胞比例高于CA初發(fā)組，Th17細(xì)胞比例低CA初發(fā)組，Treg/Th17細(xì)胞比值高于CA初發(fā)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.294,P=0.002;t=2.726,P=0.009;Z=-3.086,P=0.002)。見表1，圖1、2。

表1CA組和對照組外周血Treg、Th17細(xì)胞比例的檢測結(jié)果

Table1Proportion of Treg cells and Th17 cells in peripheral blood of CA group and control group

組別例數(shù)Treg(%)Th17(%)Treg/th17CA組524．74±1．47a1．06±0．63a4．60(3．20，8．68)a CA初發(fā)組274．14±1．081．27±0．703．52(2．47，4．85) CA復(fù)發(fā)組255．38±1．59b0．82±0．46b8．19(4．21，10．81)b對照組302．52±0．971．57±0．711．39(1．05，2．05)

A：與正常組比較P<0.05; b：與CA初發(fā)組比較，P<0.05

圖1 各組CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞比例

圖2 各組CD3+CD8-IL17+Th17細(xì)胞的比例

2.2 Foxp3 mRNA、RORγt mRNA的表達(dá)水平 CA患者外周血PBMC中Foxp3 mRNA表達(dá)水平高于對照組，RORγt mRNA表達(dá)水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z值分別為-5.122、-4.188,均P<0.001)。CA患者不同組比較：CA復(fù)發(fā)組Foxp3 mRNA表達(dá)水平高于CA初發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.236,P=0.003)，RORγt mRNA表達(dá)水平與CA初發(fā)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.713,P=0.087)。見表2。內(nèi)參基因和目的基因?qū)崟r熒光定量PCR見圖3～5。

表2CA組和對照組外周血Foxp3和RORγt mRNA的表達(dá)水平

Table2Expression of Foxp3 and RORγt mRNA in peripheral blood of CA group and control group

組別例數(shù)Foxp3mRNARORγtmRNACA組523．09(1．46，6．75)a0．36(0．23，0．63)a CA初發(fā)組273．74±3．580．34(0．23，0．72) CA復(fù)發(fā)組258．70±6．84b0．37(0．25，0．59)對照組301．20(0．44，1．63)0．93(0．68，1．62)

A：與正常組比較P<0.05; b：與CA初發(fā)組比較，P<0.05

A: 擴(kuò)增曲線;B:熔解曲線；C: 熔解峰圖

A: 擴(kuò)增曲線;B:熔解曲線；C: 熔解峰圖

A: 擴(kuò)增曲線;B:熔解曲線；C: 熔解峰圖

3 討論

CA患者存在局部和全身細(xì)胞免疫異常，包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的異常以及細(xì)胞因子失衡等[10]，且隨著病情的反復(fù)及病程延長，細(xì)胞免疫功能降低更明顯[3]，說明細(xì)胞免疫功能抑制在CA的發(fā)病及復(fù)發(fā)中扮演重要的角色。

Treg細(xì)胞是CD4+T 細(xì)胞的新亞群，在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)、調(diào)控免疫應(yīng)答方面起重要作用，在一些病毒感染性疾病中 Tregs起著非常重要的平衡作用，一方面可以抑制過度免疫反應(yīng)造成的組織損傷,另一方面還可抑制宿主對某些病原體感染時發(fā)揮有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)，不利于宿主對病原體的清除。Foxp3是目前公認(rèn)的 Tregs 最特異的分子標(biāo)記，也是其生長發(fā)育和發(fā)揮抑制功能的關(guān)鍵[11]。本研究結(jié)果顯示，CA患者外周血Treg細(xì)胞比例、Foxp3 mRNA表達(dá)水平較對照組高，復(fù)發(fā)患者高于初發(fā)患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與文獻(xiàn)[12-13]研究結(jié)果一致。筆者推測 HPV感染可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞活化和增殖，抑制宿主對HPV的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，不利于宿主對HPV的清除，導(dǎo)致了HPV的持續(xù)感染。

Th17細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種CD4+T細(xì)胞亞群，主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的動員、募集和活化，介導(dǎo)促炎癥反應(yīng)，在感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤的病理過程中發(fā)揮重要作用[14]。RORγt是維甲酸相關(guān)孤兒核受體家族成員之一，在IL-6與TGF-β協(xié)同作用下，可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞生成，是Th17細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子。本研究結(jié)果顯示，CA患者外周血Th17 細(xì)胞比例、RORγt mRNA表達(dá)水平低于正常對照組，復(fù)發(fā)患者Th17 細(xì)胞比例低于CA初發(fā)患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，與孫廣政[15]的研究結(jié)果一致，但與翁智勝等[16]的研究不同。筆者推測CA患者Th17細(xì)胞比例及RORγt mRNA表達(dá)水平降低，使機(jī)體抑制HPV病毒復(fù)制的能力下降，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制，不能有效清除HPV病毒。盡管目前研究結(jié)果不一致，但都認(rèn)為Th17 細(xì)胞可能與CA的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)有關(guān)，但具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

Treg細(xì)胞與 Th17細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相關(guān)性，分化上密切關(guān)聯(lián)，功能上相互拮抗，生理情況下Treg細(xì)胞與 Th17細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，維持機(jī)體免疫功能的平衡與穩(wěn)定，TGF-β和IL-6在這一平衡中起到關(guān)鍵的作用。當(dāng)感染存在時，TGF-β聯(lián)合IL-6共同促進(jìn)Th17細(xì)胞分化；感染清除后，IL-6表達(dá)下降，TGF-β可促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化。本研究結(jié)果還顯示，CA患者外周血Treg/Th17細(xì)胞比值高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明CA患者外周血存在Treg/Th17細(xì)胞失衡，其平衡向Treg細(xì)胞方向偏移。Treg細(xì)胞比例升高，導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制和免疫無能，同時抑制Th1和Th2分化，從而負(fù)向調(diào)節(jié)Th1和Th2介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化、免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)；Th17細(xì)胞降低，會減弱機(jī)體對炎癥因子和趨化因子級聯(lián)反應(yīng)等，從而導(dǎo)致HPV病毒持續(xù)感染。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CA復(fù)發(fā)患者Treg/Th17比值高于CA初發(fā)患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示CA復(fù)發(fā)患者Treg/Th17平衡紊亂更顯著，表明Treg/Th17細(xì)胞平衡紊亂與CA復(fù)發(fā)有關(guān)，并可能在CA復(fù)發(fā)機(jī)制中起重要作用。

綜上所述， CA患者存在Treg/Th17細(xì)胞失衡，復(fù)發(fā)患者Treg/Th17細(xì)胞失衡更顯著，Treg/Th17細(xì)胞失衡在CA發(fā)病及復(fù)發(fā)機(jī)制中可能起重要作用，臨床上可通過恢復(fù)Treg/Th17細(xì)胞之間平衡，促進(jìn)HPV病毒的清除，減少CA的復(fù)發(fā)。本實驗結(jié)果對傳統(tǒng)的 CA 患者Th1/Th2 失衡理論進(jìn)行了補(bǔ)充，但Th17、Treg與Th1、Th2細(xì)胞之間如何進(jìn)行調(diào)節(jié)以及與感染HPV亞型的相關(guān)性還有待進(jìn)一步的研究。

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BalanceofTreg/Th17cellsandtheexpressionofrelatedtranscriptionfactorsinperipheralbloodofpatientswithcondylomaacuminatum

CHENHua1,2,XIONGQi1,CHENYong-yan1

(1AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China; 2ChongqingQijiangDistrictPeople’sHospital,Qijiang401420,China)

ObjectiveTo evaluate the role and significance of Treg/Th17 cells imbalance in pathogenesis and recurrence mechanism of condyloma acuminatum (CA).Methods52 patients with CA were selected as study group(CA group， 27 with initial occurrence of CA, 25 with recurrence of CA), 30 healthy persons were as control group, flow cytometry was used to detect the proportion of Treg cells and Th17 cells in the peripheral blood, the expression level of Foxp3 mRNA and RORγt mRNA in peripheral blood mononuclear cells was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction.ResultsThe proportion of Treg cells and the expression level of Foxp3 mRNA in peripheral blood in CA group was higher than that in control group, recurrence CA group was higher than initial occurrence CA group, difference was significant(bothP<0.05); the proportion of Th17 cells and expression level of RORγt mRNA in CA group was significantly lower than that in control group, proportion of Th17 cells in recurrence CA group was lower than initial occurrence CA group, there was significant difference (bothP<0.05). The proporation of Treg/Th17 in CA group was higher than that in healthy controls(4.60[3.20,8.68] vs 1.39[1.05，2.05],P<0.05), recurrence CA group was higher than initial occurrence CA group (8.19[4.21,10.81] vs 3.52[2.47，4.85],P<0.05).ConclusionThere is an imbalance between Treg cells and Th17 cells in patients with CA, especially in patients with reccurrence of CA， the imbalance of Treg/Th17 cells may play an important role in the pathogenesis and recurrence mechanism of CA.

condyloma acuminatum; Foxp3; RORγt; Treg; Th17; Treg/Th17

[Chin J Infect Control，2017，16(12)：1120-1125]

2017-04-08

貴州省科學(xué)技術(shù)廳社會發(fā)展攻關(guān)項目(黔科合SY字[2013]3051號)

陳華(1992-)，女(漢族)，重慶市人，碩士研究生，主要從事皮膚分子生物學(xué)研究。

陳永艷 E-mail:cyyzy@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.12.004

R752.5+3

A

1671-9638(2017)12-1120-06

左雙燕)