高耐受性醋酸菌的研究和應用進展

張月陽,李海峰*,曹 健,2,徐孟孟

(1.河南工業大學 生物工程學院,河南 鄭州 450001;2.中原工學院 材料與化工學院,河南 鄭州 450007)

高耐受性醋酸菌的研究和應用進展

張月陽1,李海峰1*,曹 健1,2,徐孟孟1

(1.河南工業大學 生物工程學院,河南 鄭州 450001;2.中原工學院 材料與化工學院,河南 鄭州 450007)

釀醋工業的核心微生物是醋酸菌,其中最常用的菌種屬于醋酸桿菌(Acetobacter)。研究表明,具有高耐受性的醋酸菌菌株在高濃度乙醇和高溫條件下的產酸量仍可達到較高水平,對高耐受性醋酸菌菌株的發現為現代釀造工業帶來了新的發展,有利于對不同生長與代謝特征醋酸菌菌種的挖掘以及新型釀造工藝的開發。該文綜述了目前已知的高耐受性醋酸菌的特性及其在釀造工業生產中的應用進展,對更多高耐受性醋酸菌菌株的篩選以及釀造工藝的改進都具有重要的現實意義。

耐高溫;耐高濃度乙醇;醋酸菌;釀造工業

醋酸菌(aceticacidbacteria,AAB)屬于細菌域(Bacteria)、變形細菌門(Protebacteria)、α-變形菌綱(α-Protebacteria)、紅螺菌目(Rhodospirillales)、醋酸菌科(Acetobacteracese)[1],能夠氧化乙醇或糖類并生成乙酸或葡萄糖酸等有機酸,是一類重要的工業微生物,主要用于食醋與果醋飲料的生產[2]。醋酸菌不僅應用于生產葡萄糖酸、食醋和山梨酸等,還是乙醇和糖類氧化等生化反應中最重要的研究對象[3]。目前,醋酸菌在維生素C制造業、食醋釀造工業上都發揮著重要作用[4]。

在發酵生產乙酸的過程中,初始乙醇的含量和發酵溫度是影響發酵的關鍵因素。乙醇是醋酸發酵的底物,并為醋酸菌的生長代謝提供能量,當乙醇含量超過4%vol時,醋酸菌的生長會受到抑制[5]。另一方面,溫度是影響醋酸菌生長和代謝的重要因素,是醋酸菌氧化乙醇生成乙酸的必要條件。但是溫度過高會使醋酸菌發酵的基本酶類變性,細胞膜受損傷,導致細胞分散[6]。因此,篩選出同時具有耐高濃度乙醇、耐高溫和高產酸特性的醋酸菌則有利于醋酸菌發酵過程的優化,而其自身所具有的其他特異性功能也有巨大的研究與應用價值。

1 高耐受性醋酸菌特性

1.1 醋酸菌的生物學特性

醋酸菌屬于革蘭氏陰性嚴格需氧的細菌,目前已報道的醋酸菌共有16個屬,其中最主要的是醋酸桿菌屬(Acetobacter)、葡萄糖桿菌屬(Gluconobacter)和葡萄糖醋酸桿菌屬(Gluconacetobacter)。細胞形態有:橢圓、桿狀、單生、成對或成鏈排列,細胞大小為(0.6～0.8)μm×(1.0～3.0)μm[7-8]。在有的種中退化型是非常常見的,呈現出球狀的、絲狀的、膨大的、成堆的、彎曲的、絲狀的或者分枝的形態。細胞運動或不運動,運動型產周生鞭毛或極生鞭毛。一些菌株能產生色素或者纖維素,最適生長溫度為28～36℃,最適pH值為5.4～6.3[9]。

1.2 高耐受性醋酸菌的發酵特性

1.2.1 高耐受性醋酸菌的耐高濃度乙醇能力

高耐受性醋酸菌一般都具有耐高濃度乙醇的能力。孫文瑛等[10]用溴甲酚綠平板法從腐爛水果中成功分離純化出一株耐體積分數為11%的乙醇與38℃高溫的醋酸菌,該菌種在經過優化培養之后,產酸量可達到48.6 g/L。侯小歌等[11]對宋河大曲中的醋酸菌進行分離鑒定時,發現其中醋酸桿菌屬(Acetobacter)的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)和醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)在產酸過程中可耐受5%vol～11%vol的乙醇,其中氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)的產酸性能受到含量為9%vol～11%vol乙醇的影響。另外吳曉英[12]也發現了巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)的誘變菌種可以耐受11%vol的乙醇,而后發現該菌株在高濃度乙醇條件下,可以通過代謝合成細胞活性保護物質,如脯氨酸、亮氨酸和海藻糖等,從而維持細胞膜的流動性,為定向改造菌種提供了依據。陳洋等[13]在釀醋的醋醅中篩選出了耐受12%vol的乙醇與43℃高溫的醋酸菌,并初步揭示了其耐受機理與乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)和乙酸脫氫酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)的活性有密切關系。

1.2.2 高耐受性醋酸菌耐高溫的能力

在對高耐受性醋酸菌的研究過程中發現,大多數的醋酸菌表現出良好的耐熱性能。醋酸桿菌菌株(Acetobacter senegalensis)CWBI-B418r是從塞內加爾的芒果中分離出來的,這種新型菌株是嚴格的好氧菌,可在酵母葡萄糖礦物鹽瓊膠(yeast glucose mineral agar,YGM)培養基中35℃的條件下表現出最佳生長狀態,并且在40℃時生長良好[14]。SOENPHOL W等[15]的研究表明,熱帶醋酸桿菌(Acetobacter tropicalis)SKU1100具有很好的耐熱性能,甚至可以在40℃以上的條件下生長,還可以通過誘變獲得產多糖的菌株,產生一種由半乳糖、葡萄糖和鼠李糖組成的薄皮多糖,并能夠依附在細菌的表面上[16]。巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)具有其特別的耐受性,不僅可以耐受體積分數12%的乙醇,并且可以耐受43℃的高溫,這一研究結果對釀醋工業具有非常重要的影響[12-13]。

1.2.3 高耐受性醋酸菌的高產酸能力

在醋酸發酵過程中的產酸速率和產酸濃度是衡量醋酸菌菌種優劣的主要指標。優良的適合高濃度醋酸發酵的醋酸菌應該具備高效的氧化乙醇的酶系,對高濃度的醋酸具有良好的耐受性并且產酸速率快。張志燕等[17]從鎮江香醋醋醅中分離得到了8株醋酸菌,對其分析結果表明,醋酸菌D-3-4的產酸量達到60 g/L,并且可耐受體積分數9%的乙醇以及42℃的高溫,為優勢高產酸菌株。姜曉芝等[18]從自制的果醋飲品中分離得到醋酸菌F9,經發酵測定其產酸量為56.3 g/L,可耐受體積分數11%的乙醇,并初步鑒定為醋化醋桿菌(Acetobacter aceti)。另外日本的正井博之成功地分離了在10%的酸度以上還能繼續繁殖并產酸的醋酸菌(Acetobacter polyoxogenessp.nov),說明該醋酸菌在產酸過程中,酸度對其發酵的性能影響不大,還可以保持高產酸的能力[19]。王金丹等[20]發現了醋酸菌耐乙酸的機制與醋酸菌的ABC轉運子、質子動力勢外排泵、乙酸過氧化反應和基因與酶調控等有密切關系,為篩選高耐酸的醋酸菌種提供了依據。

1.2.4 高耐受性醋酸菌的發酵機制和產物

研究發現,高耐受性醋酸菌具有耐高溫、耐高濃度乙醇以及高產酸及耐酸的能力與其自身獨特的生理特性有關。高乙醇濃度下醋酸菌的乙醇脫氫酶(ADH)和乙酸脫氫酶(ALDH)仍然能夠保持較高的活力從而保證了乙醇呼吸鏈的產能,并且能夠有效地調節菌體內的碳代謝、脂代謝和氨基酸代謝,同時合成細胞活性保護物質,調節自身細胞膜脂肪酸組成并維持細胞膜一定的流動性[12]。另外,從酶學方面來講,在發酵過程中ADH和ALDH的酶活力與醋酸菌的高耐受性也有很大關系。高乙醇濃度條件下,ALDH的酶活力明顯會高于ADH,因此ADH成了高乙醇濃度條件下發酵過程中的限速酶。同時,高乙醇濃度條件下,酶活力越高,菌種所能轉化的乙醇就會越多,菌種的生長越好,耐乙醇能力越強[13]。研究高溫和乙酸對兩種酶的影響,結果表明,菌種對高溫的耐受性與它們的ADH和ALDH活力呈正相關;乙酸的存在對ADH和ALDH的酶活力具有較強的抑制作用。而耐高濃度乙醇的醋酸菌同時具有耐高溫與耐酸的特性,這兩種特性均有利于提升其對乙醇的耐受性[13]。

2 高耐受性醋酸菌的應用

2.1 高耐受性醋酸菌在釀醋工業中的應用

醋酸發酵過程是食醋釀造過程中最重要最關鍵的一個環節。通過對老陳醋不同發酵時間中醋醅產酸菌的變化趨勢的綜合分析,發現在發酵過程中最主要的菌種就是醋酸桿菌(Acetobactersenegalensis)和乳酸桿菌(Lactobacillus),這兩種菌是釀醋工業中最主要的微生物[21]。而在食醋的釀造特別是深層發酵過程中,由于乙醇是醋酸發酵的底物,并會為醋酸菌的生長代謝等生命活動提供能量,因此乙醇的初始體積分數一般都會＞6%。而當乙醇的體積分數超過4%時,普通醋酸菌的生長就會受到一定的抑制[22]。乙醇會影響細胞膜的組織結構,改變其通透性,導致細胞生長緩慢產酸量降低[23]。此外,醋酸菌在發酵過程中會產生熱量積累,隨著發酵的進行,培養溫度會逐漸升高從而超過醋酸菌的最適生長溫度,溫度過高就會使醋酸菌生長的酶系變性,導致細胞膜受損傷影響產酸[6]。在釀醋的深層發酵工藝中,初始乙醇體積分數較高,另外夏季高溫時控制最適溫度耗費的冷卻成本太大,而利用高耐受性的醋酸菌菌株就可以改善上述問題。因此,高耐受性醋酸菌的耐高溫以及耐乙醇的特性在釀醋工業中將會得到更廣泛的應用,其潛在的價值也會得到深入的開發。

2.2 高耐受性醋酸菌在功能性飲料中的應用

近年來功能性飲料受到了越來越多消費者的青睞,主要是因為其具有多種基礎氨基酸、有機酸等有益健康的成分,可以調節人體的酸堿平衡,具有提高免疫力等功能[24]。市場上的功能性飲料主要是通過多種菌種混合發酵而成。果醋就是其中的一種。果醋以水果或其濃縮的果汁(漿)等為主要原料,通過酵母菌和醋酸菌混合發酵而成[25]。果醋的制作一般都是利用微生物的二次發酵獲得的,第一次為酵母菌發酵,將糖轉化為乙醇,第二次為醋酸菌發酵,將乙醇轉化為乙酸,再經過調配而成[26]。在制作果醋的過程中,醋酸菌的發酵過程受限于酵母菌的發酵,酵母菌轉化乙醇的量過多就會抑制醋酸菌的發酵,致使醋酸菌的產酸量降低,從而影響得到的果醋的口感。因此高耐受性、高產酸量醋酸菌的應用就有利于解決果醋生產過程中醋酸菌生長受抑制的問題。

2.3 高耐受性醋酸菌在生物轉化中的應用

生物轉化是指利用全細胞或者提取的酶作為催化劑將底物轉化為可利用的目標產物的過程[27]?；诟吣褪苄源姿峋毺氐拇x方式,使其在用于工業規模的生物轉化中發揮重要作用。醋酸菌對于乙醇的氧化主要是醋酸菌中獨特的氧化酶系,第一步是乙醇脫氫酶(ADH)將乙醇催化生成乙醛,第二步由乙醛脫氫酶(ALDH)將乙醛催化生成乙酸[28]。研究其中的重要氧化酶系對制醋工業的菌株選育有著重要的意義。另外在醋酸菌氧化乙醇的過程中會不斷產酸,致使pH值不斷降低,但是醋酸菌卻仍然可以生長,這與其耐受性有很大關系。除了用于釀醋,醋酸菌還可以通過自身特殊的生物轉化功能參與生產可可、纖維素等產品。在可可豆莢的發酵過程中隨著乙醇體積分數的增加和溫度的升高,酵母菌和乳酸菌的生長會受到抑制,這時由于高耐受性醋酸菌獨特的代謝活動,其活性則不會受到太大影響,相反,充足的氧氣和低的pH使其更加活躍。因此高耐受性醋酸菌也可以用于生物發酵過程的改進[29]。另外,醋酸菌也能夠合成纖維素,其中木葡糖醋酸桿菌(Gluconacetobacter xylinus)是主要的功能菌,表現出對乙酸較高的耐受性(10%)[30],所合成的纖維素是目前已知的天然纖維中性能最好的纖維素,其纖維直徑大概為10～100nm,但彈性指數卻是普通纖維的幾十倍[31]。隨著生物轉化研究工作的深入,對高耐受性高產酸醋酸菌的研究也越來越全面,生物轉化的基礎研究以及應用研究也會得到更快的發展,人們將會更多地受益于生物轉化[32]。

3 結論與展望

高耐受性醋酸菌由于其具有耐高溫、耐乙醇以及高產酸能力而被廣泛應用于發酵食醋、功能性飲料果醋與生物轉化等方面。醋酸菌的發酵過程主要依靠ADH、ALDH酶系的催化作用,而這兩種酶的特性也影響著醋酸菌的產酸速率和耐受能力,并且可以通過誘變、篩選和基因工程等手段獲得高耐受性高產酸的醋酸菌菌種。醋酸菌發酵過程中所產生的有機酸、氨基酸和活性多糖成分對人體的健康有著重要的保健和醫療作用,另外,高耐受性醋酸菌的潛在價值也需要研究學者們繼續開發。

隨著對高耐受性醋酸菌耐受機制的深入研究,以及基因轉錄和基因重組技術、16S～23S rDNA等醋酸菌的快速檢測技術在醋酸菌選育上的應用[33],人們可以構建出耐更高溫度、乙醇濃度以及高產酸量的醋酸工程菌株,而這也將大大提高我國對醋酸菌的利用率,降低工業生產的能耗,發展環保節能的醋酸菌利用產業。

[1]周德慶.微生物學教程.第3版[M].北京:高等教育出版社,2011:336-338.

[2]王 斌,陳福生.醋酸菌的分類進展[J].中國釀造,2014,33(12):1-10.

[3]SAINZ F,NAVARRO D,MATEO E,et al.Comparison of D-gluconic acid production in selected strains of acetic acid bacteria[J].Int J Food Microbiol,2016,222(99)：40.

[4]楊立霞,李 錦.醋酸菌在生物轉化中的應用[J].煤炭與化工,2012,35(4):35-38.

[5]PITIWITTAYAKUL N,YUKPHAN P,SINTUPRAPA W,et al.Identification of acetic acid bacteria isolated in Thailand and assigned to the genusAcetobacter,by groEL,gene sequence analysis[J].Ann Microbiol,2015(3)：1-8.

[6]ORY I D,ROMERO L E,CANTERO D.Modelling the kinetics of growth ofAcetobacter aceti,in discontinuous culture：influence of the temperature of operation[J].Appl Microb Biotechnol,1998,49(2)：189-193.

[7]LI L,PRAET J,BORREMANS W,et al.Bombella intestinigen.nov.sp.nov.a novel acetic acid bacterium isolated from bumble bee crop[J].Int J Syst Evolut Microbiol,2015,65(1)：267-273.

[8]GREENBERG D E,PORCELLA S F,STOCK F,et al.Granulibacter bethesdensisgen.nov.sp.nov.a distinctive pathogenic acetic acid bacterium in the familyAcetobacteraceae[J].Int J Syst Evolut Microbiol,2006,56(11)：2609-2616.

[9]PITIWITTAYAKUL N,YUKPHAN P,CHAIPITAKCHONLATARN W,et al.Acetobacter thailandicussp.nov.for a strain isolated in Thailand[J].Ann Microbiol,2015,65(4)：1855-1863.

[10]孫文瑛,陳 雄,王 志,等.耐高溫高醇醋酸菌的篩選及其發酵工藝的初步優化[J].中國釀造,2011,30(1):44-47.

[11]侯小歌,杜紅陽,李學思,等.宋河大曲中醋酸菌的分離鑒定及產酸特性[J].中國釀造,2011,30(4):112-115.

[12]吳曉英.耐乙醇巴氏醋桿菌選育及其耐受機制研究[D].天津:天津科技大學,2015.

[13]陳 洋.耐乙醇醋酸菌特性研究及應用[D].武漢:湖北工業大學,2016.

[14]NDOYE B,CLEENWERCK I,ENGELBEEN K,et al.Acetobacter senegalensissp.nov.a thermotolerant acetic acid bacterium isolated in Senegal(sub-Saharan Africa)from mango fruit(Mangifera indicaL.)[J].Int J Syst Evolut Microbiol,2007,57(7)：1576-1581.

[15]SOEMPHOL W,DEERAKSA A,MATSUTANI M,et al.Global analysis of the genes involved in the thermotolerance mechanism of thermotoerantAcetobacter tropicalisSKU1100[J].Biosci Biot Biochem,2011,75(10)：1921-1928.

[16]MATSUTANI M,HIRAKAWA H,NISHIKURA M,et al.Increased number of Arginine-based salt bridges contributes to the thermotolerance of thermotolerant acetic acid bacteria,Acetobacter tropicalis SKU1100[J].Biochem Biophys Res Communicat,2011,409(1)：120-124.

[17]張志燕,錢靜亞,馬 真,等.鎮江香醋醋醅中優勢高產酸醋酸菌菌株的篩選[J].食品工業科技,2016,37(11):174-178.

[18]姜曉芝,李志西,楊甲平,等.產酸菌株的分離及初步鑒定[J].中國釀造,2008,27(23):53-56.

[19]覃 莉,王 志,陳 雄,等.酵母菌醋酸菌混菌發酵高產醋酸工藝研究[J].中國釀造,2012,31(1):144-147.

[20]王金丹,張寶善,李亞武,等.醋酸菌耐酸機制的研究進展[J].中國釀造,2014,33(11):10-14.

[21]呂艷歌,馬海樂,李云亮,等.山西老陳醋產酸菌的分離鑒定及系統學分析[J].中國食品學報,2013,13(12):163-171.

[22]ZHENG Y,ZHANG K P,WANG C X,et al.Improving acetic acid production ofAcetobacter pasteurianusAC2005 in hawthorn vinegar fermentation by using beer for seed culture[J].Int J Food Sci Technol,2010,45(11)：2394-2399.

[23]KRISCH J,SZAJANI B.Ethanol and acetic acid tolerance in free and immobilized cells ofSaccharomyces cerevisiaeandAcetobacter aceti[J].Biotechnol Lett,1997,19(6)：525-528.

[24]丁煥.中國飲料業發展向功能化前進——運動·健康的2007飲料[J].食品工業科技,2007,28(7):14-16.

[25]鮑金勇,王 娟,林碧敏,等.我國果醋的研究現狀、存在的問題及解決措施[J].中國釀造,2016,35(10):1-4.

[26]王 敏.發酵型果醋飲料的研究現狀與發展趨勢[J].飲料工業,2016,19(3):76-78.

[27]SCHOEMAKER H E,MINK D,WUBBOLTS M G.Dispelling the myths-biocatalysis in industrial synthesis[J].Science,2003,299(5613)：1694-1697.

[28]楊立霞,李 錦.醋酸菌在生物轉化中的應用[J].煤炭與化工,2012,35(4):35-38.

[29]NIELSEN D S,TENIOLA O D,BANKOFFI L,et al.The microbiology of Ghanaian cocoa fermentations analysed using culture-dependent and culture-independent methods[J].Int J Food Microbiol,2007,114(2)：168.

[30]MIKKELSEN D,FLANAGAN B M,DYKES G A,et al.Influence of different carbon sources on bacterial cellulose production byGluconacetobacterxylinusstrain ATCC53524[J].J Appl Microbiol,2009,107(2)：576-583.

[31]GHOSH S,PAWAR H,PAI O,et al.Microbial transformation of quinic acid to shikimic acid byBacillus megaterium[J].Bioresource Bioprocess,2014,1(1)：7.

[32]SAICHANA N,MATSUSHITA K,ADACHI O,et al.Acetic acid bacteria：A group of bacteria with versatile biotechnological applications[J].Biotechnol Adv,2015,33(2)：1260-1271.

[33]TRCEK J.Quick identification of acetic acid bacteria based on nucleotide sequences of the 16S-23S rDNA internal transcribed spacer region and of the PQQ-dependent alcohol dehydrogenase gene[J].Syst Appl Microbiol,2005,28(28)：735-745.

ZHANG Yueyang1,LI Haifeng1*,CAO Jian1,2,XU Mengmeng1
(1.College of Bioengineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China;2.School of Materials and Chemical Engineering,Zhongyuan University of Technology,Zhengzhou 450007,China)

TQ939.99

0254-5071(2017)11-0011-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.003

2017-04-19

河南省教育廳科學技術研究重點項目(14A180021);省屬高?；究蒲袠I務費專項資金項目(No.2014YWQQ18)

張月陽(1993-),女,碩士研究生,研究方向為食品加工與安全。

*通訊作者:李海峰(1984-),女,副教授,博士,研究方向為食品微生物學。