酵母菌FW-sc-08的生長及發酵特性研究

李亞輝,周劍忠*,王 英,朱佳娜

(江蘇省農業科學院 農產品加工研究所,江蘇 南京 210014)

酵母菌FW-sc-08的生長及發酵特性研究

李亞輝,周劍忠*,王 英,朱佳娜

(江蘇省農業科學院 農產品加工研究所,江蘇 南京 210014)

通過對影響菌體生長因素、發酵指標和香氣成分的測定,研究了從自然發酵黑莓酒中篩選出的酵母菌FW-sc-08的生長和發酵特性。結果顯示,酵母菌FM-sc-08對數生長期為3～9 h,對SO2最大耐受質量濃度為800 mg/L;酵母菌FM-sc-08適宜發酵的可發酵糖最大含量為30%,對糖最大耐受量為40%,可發酵酒精度最高16.3%vol。通過測定不同溫度對發酵指標的影響,最終確定酵母菌FM-sc-08的最適發酵溫度為25℃;對比20℃和25℃發酵的黑莓果酒酒樣中的香氣成分,可知酵母菌FM-sc-08在20℃發酵黑莓酒產香氣成分較多(35種)。

黑莓酒;酵母菌FM-sc-08;生長特性;發酵特性

黑莓(blackberry),又名覆盆子,屬于薔薇科(Rasaceae)懸鉤子屬(Rubrs),實心莓亞屬(Eubatus),是多年生灌木小漿果[1]。黑莓起源于歐洲和北美,于20世紀80年代由江蘇省中科院植物研究所引入中國。江蘇省是我國黑莓主要種植地,面積約占我國種植面積的約80%[2-3]。黑莓果實營養物質豐富,具有較高的營養價值,被譽為“黃金水果”和“生命之果”等[4-5]。黑莓酒是以黑莓為原料的酒類制品,其不僅最大限度地保留了黑莓果實中的營養成分和保健功能因子,而且通過生物發酵還產生了大量生物活性物質,長期飲用具有美容養顏、降血壓、降血脂、保護血管、減緩衰老等多種功效[6-8]。但黑莓酒中有機酸含量高,口感較差,難以被人們接受,嚴重影響了黑莓酒的品質和市場發展[9]。黑莓酒中最主要的有機酸是蘋果酸,蘋果酸是一種具有強烈辛酸味的雙羧基酸,口感較差[10-11]。如何降低黑莓酒中有機酸含量和酸度,是目前生產企業和科研人員關注的問題[12]。

降酸處理是很多果酒釀造中必不可少的步驟,對新生果酒進行降酸處理主要通過物理、化學和生物降酸等方法來實現[13-15]。物理降酸法在實際生產中耗時長且成本高;化學降酸法降酸效果好,但易導致酒體失去平衡;生物降酸法是通過微生物將二元酸轉化為一元酸,從而達到降酸目的[16-19]。生物降酸又稱蘋果酸乳酸發酵,此法效率高、成本低、無污染、降酸效果好,還能增加果酒的香氣物質、改善果酒的風味[20-21]。因此生物降酸是目前果酒釀造中首選的降酸方法,也是果酒發酵領域研究的熱點[22]。

為了解決黑莓酒酸度較高的問題,本課題組從自然發酵黑莓果酒中分離出各類形態不同的酵母,通過高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)對有機酸測定,篩選出1株具有良好蘋果酸降解性能的菌株FW-sc-08,通過生理生化及分子生物學鑒定,該菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[12]。本研究在前期研究基礎上,對篩選出的S.cerevisiaeFW-sc-08的生長和發酵特性,以及其對黑莓酒風味的影響進行了系統研究。以期優化黑莓酒發酵工藝、改善黑莓酒口感、提高黑莓酒整體品質、促進黑莓酒產業的發展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑莓:江蘇省溧水區黑莓基地;酵母菌FW-sc-08:本實驗室從自然發酵黑莓酒中篩選得到。

檸檬酸、偏重亞硫酸鉀(均為分析純):國藥集團化學試劑有限公司;果膠酶(4 000 U/g)、果漿酶(3 000 U/g):諾維信生物技術有限公司;酚酞、蒽酮(均為分析純):上海浦口化學試劑有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基:廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SJ-CJ-2FQ潔凈工作臺:蘇州安泰空氣技術有限公司;LRH-150生化培養箱:上海一恒科技有限公司;THZ-C-1臺式冷凍恒溫振蕩機:太倉市實驗設備廠;SevenEasyplus pH儀:梅特勒-托利多儀器上海有限公司;TGL-16C臺式離心機:上海安亭科學儀器廠;YXYQ型水浴鍋:常州國華電器有限公司;723型可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司;XPE電子分析天平:浙江凱豐集團有限公司;SPX-200電熱干燥培養箱:南京實驗儀器廠;TRACE氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatogram-mass spectrometry,GC-MS):美國Finnigan公司;Supeclo-24固相微萃取裝置及萃取頭(50/30 mDvB,CAR/PDMS):美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株FW-sc-08生長特性測定

菌株生長曲線繪制:將活化的酵母菌FM-sc-08菌液按2%接種量接種于PDA液體培養基中,于25℃恒溫培養,每3 h取樣一次,在波長600 nm處測菌液吸光度值(OD600nm),繪制菌株生長曲線。

菌株酸耐受性測定:將活化的酵母菌FM-sc-08菌液按2%接種量分別接種于pH值為1.5、2.0、2.5、3.0和3.5的PDA液體培養基中,以自然pH(4.5)PDA液體培養基培養組為對照,于25℃恒溫培養,每3 h取樣一次,在波長600 nm處測菌液吸光度值(OD600nm)。

菌株SO2耐受性測定:將活化的酵母菌FM-sc-08菌液按2%接種量分別接種于SO2質量濃度為500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L、800 mg/L和900 mg/L的PDA液體培養基中(以偏重亞硫酸鉀形式加入),以不添加SO2的PDA液體培養基對照,于25℃恒溫培養,每3 h取樣一次,在波長600 nm處測菌液吸光度值(OD600nm)。

1.3.2 黑莓果酒制作工藝流程和操作要點

操作要點:將黑莓果實打漿后,加入0.25%果膠酶和0.25%果漿酶,40℃酶解4～5 h,過濾,添加0.005%二氧化硫(加入0.01%偏重亞硫酸鉀)攪拌均勻,按照0.5%接種量接入菌株FM-sc-08,添加一定量的蔗糖后,25℃發酵,當殘糖含量＜4 g/L時即表示發酵結束,發酵結束后立即分離,自然澄清15～20d后,用硅藻土下膠,然后在0℃冷凍處理,最后用0.45 μm膜過濾后灌裝。

1.3.3 菌株FW-sc-08發酵特性測定

菌株可發酵糖含量測定:按1.3.2工藝操作要點,分別按25%、30%、35%、40%添加量加蔗糖后發酵,每天取樣品分別測定發酵液殘糖含量。

菌株發酵酒精度測定:按1.3.2工藝操作要點,先加糖15%進行發酵,然后每天添加5%的蔗糖,同時每天取樣測定殘糖含量,直至被發酵的糖總量穩定為止,此時測定黑莓果酒酒精度。

不同溫度下發酵指標測定:按照1.3.2工藝操作要點,添加20%的蔗糖,然后分別在10℃、15℃、20℃、25℃和30℃下進行恒溫發酵,每天取樣測定其總酸、總糖含量和pH;當發酵至殘糖含量＜0.4%時,取樣測定發酵液總SO2、游離SO2含量和酒精度。

1.3.4 理化指標檢測方法

殘糖含量:參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定;pH值:采用pH儀進行測定;總酸、總糖、總SO2、游離SO2和酒精度測定參照國標GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定。

1.3.5 菌株FW-sc-08發酵黑莓果酒香氣成分測定

香氣成分的提取:按照1.3.2所述發酵工藝流程,分別在20℃和25℃進行恒溫發酵,發酵結束后取樣進行香氣成分分析,以黑莓汁作為對照。取20℃和25℃發酵的黑莓果酒酒樣及黑莓汁各2.5 mL,分別加入到10 mL頂空瓶中,加入0.75 g NaCl溶解,于40℃條件下萃取40 min。萃取后,在進樣口溫度250℃解吸10 min。

氣相色譜條件:色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣口溫度250℃,程序升溫40℃,保持5 min,以10℃/min升溫到250℃,保持10 min;傳輸線溫度280℃,載氣高純氦氣(He)(99.999%),進樣量0.3 μL,載氣流速1.0 mL/min[23]。

質譜條件:電離方式為電子電離(electronionization,EI)源,電子能量70 eV,離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃,掃描范圍35～500u,對采集到的質譜圖利用NIST 08.L譜庫進行檢索,并采用氣相色譜峰面積歸一化法定量計算出各香氣成分的相對含量。

1.3.6 數據分析

利用SPSS18.0和Design Expert V8.0數據處理軟件進行數據處理及統計分析。

2 結果與分析

2.1 菌株FW-sc-08生長特性

2.1.1 菌株生長曲線測定

由圖1可知,菌株FM-sc-08在PDA液體培養基中生長良好,延滯期較短,很快進入對數生長期,3～9 h為對數生長期,9～18 h為穩定期,18 h以后時進入衰亡期。

圖1 酵母菌FM-sc-08菌株生長曲線Fig.1 Growth curve ofS.cerevisiaeFM-sc-08

2.1.2 菌株酸耐受性測定

圖2 不同pH值對酵母菌FM-sc-08生長的影響Fig.2 Effects of different pH value on growth of S.cerevisiaeFM-sc-08

菌株FM-sc-08的酸耐受性試驗檢測結果如圖2所示。由圖2可知,在對照組(pH 4.5)和試驗組pH 3.5條件下,菌體OD600nm值迅速上升,且明顯高于其他試驗組,說明菌體FM-sc-08生長良好;當培養基pH值分別為3.0和2.5時,菌體生長緩慢,生長曲線明顯出現滯后現象,延滯期和對數生長期明顯延長,且pH越低滯后現象越嚴重;在pH 2.0和pH 1.5條件下菌體幾乎沒有生長。因此,菌株FM-sc-08可耐受pH3.5的酸性環境。

2.1.3 菌株SO2耐受性測定

酵母菌FM-sc-08的SO2耐受性試驗結果如圖3所示。由圖3可知,對照組菌體生長良好;當SO2質量濃度為500～800 mg/L時,菌體生長緩慢,生長曲線明顯出現滯后現象,延滯期和對數生長期明顯延長,且隨著SO2質量濃度的增加,生長越來越慢,滯后現象越來越嚴重;當SO2質量濃度為900 mg/L時,菌體幾乎沒有生長。因此,菌株FM-sc-08對SO2的最大耐受質量濃度為800 mg/L。

圖3 不同SO2質量濃度對酵母菌FM-sc-08生長的影響Fig.3 Effects of different concentration of SO2on growth of S.cerevisiaeFM-sc-08

2.2 菌株FW-sc-08發酵特性

2.2.1 可發酵糖含量的測定

菌株FM-sc-08發酵黑莓酒可發酵糖含量測定結果如表1所示。由表1可知,當蔗糖添加量為25%、30%、35%和40%時黑莓發酵液中殘糖含量分別為(30.66±2.02)%、(35.69±3.02)%、(40.08±3.65)%和(44.89±4.23)%,說明黑莓果汁中原有蔗糖含量約為5%。當蔗糖添加量為25%時,發酵10 d后,殘糖含量降至(0.45±0.04)%,蔗糖消耗量為30.21%,說明發酵完全;當蔗糖添加量為30%、35%和40%時,殘糖量分別在發酵8 d、9 d和4 d后趨于穩定,分別約為6%、10%和20%,蔗糖消耗量分別約為30%、30%和25%。表明蔗糖添加量為25%、30%和35%時,最終蔗糖消耗量均約為30%,當添加量為40%時,蔗糖消耗量下降,說明酵母菌FM-sc-08在發酵中可發酵糖的最大量約為30%。

表1 酵母菌FM-sc-08可發酵糖含量檢測結果Table 1 Determination results of fermentable sugar contents byS.cerevisiae FM-sc-08

2.2.2 菌株發酵產酒精測定

酵母菌FM-sc-08發酵產酒精測定結果如表2所示。由表2可知,發酵至第7天時添加蔗糖5%后,殘糖含量為19.82%,比第6天的殘糖含量多約5%,說明此時糖已基本不再被消耗,且第8、9和10天不再加糖,殘糖含量保持不變,說明第6天時發酵已完全;隨著發酵時間的延長,酒精度逐漸上升,從第6天開始趨于穩定,基本維持在16.1%vol左右,進一步說明第6天時發酵已結束。表明酵母菌FM-sc-08可發酵產生酒精度最大為16.3%vol,發酵時間為6 d。

表2 酵母菌FM-sc-08的可發酵酒精檢測結果Table 2 Determination results of ethanol content byS.cerevisiae FM-sc-08

2.2.3 不同溫度下發酵指標測定

酵母菌FM-sc-08在不同溫度下發酵生產黑莓果酒,殘糖含量變化如圖4所示。由圖4可知,隨著發酵溫度的升高,發酵速度逐漸加快;當發酵溫度為10℃時,殘糖含量下降較小,說明發酵基本不進行;當發酵溫度為15℃時,殘糖含量下降緩慢,發酵至16 d時,殘糖含量為12.4%,說明發酵速度較慢;當發酵溫度為20℃時,殘糖含量明顯下降,發酵至第12天時,殘糖含量約為0.5%,表明發酵基本完全;當發酵溫度為25℃時,殘糖含量有較為明顯下降,發酵至第10天時,殘糖含量約0.6%,表明發酵基本完全;當發酵溫度為30℃時,殘糖含量下降最快,發酵至第8天時,殘糖含量約0.8%,表明發酵基本完全,但與25℃相比相同發酵時間點殘糖含量沒有較大差異。因此,菌株FM-sc-08最適宜發酵溫度為25℃。

圖4 不同溫度下黑莓果酒發酵過程中殘糖含量的變化Fig.4 Changes of residual sugar content during fermentation at different temperatures

酵母菌FM-sc-08在不同溫度下發酵生產黑莓果酒,pH值變化如圖5所示。由圖5可知,當發酵溫度為10℃和15℃時,發酵液pH值變化不大,當發酵溫度為20℃、25℃和30℃時,發酵液pH值均有明顯的上升,從2.68逐漸上升到3.30左右,其中發酵溫度為25℃和30℃時變化最為明顯。因此,最適宜發酵溫度為25℃。

圖5 不同溫度下發酵pH值的變化Fig.5 Changes of pH value during fermentation at different temperatures

酵母菌FM-sc-08在不同溫度下發酵生產黑莓果酒,總酸含量變化如圖6所示。由圖6可知,在不同溫度下發酵,黑莓果酒總酸含量呈現出下降趨勢。當發酵溫度為10℃和15℃時,發酵液總酸含量有較小的下降;當發酵溫度為20℃、25℃和30℃時,總酸含量有明顯的下降。在25℃和30℃時總酸含量下降最多,且在兩個溫度下沒有顯著差異。因此,最適宜發酵溫度為25℃。

圖6 不同溫度下發酵總酸含量的變化Fig.6 Changes of total acid contents during fermentation at different temperatures

表3 不同溫度發酵后黑莓果酒中SO2含量和酒精度測定Table 3 Determination of SO2and alcohol contents after fermentation at different temperatures

酵母菌FM-sc-08在不同溫度下發酵生產黑莓酒,發酵結束后SO2含量和酒精度測定結果如表3所示。由表3可知,隨著發酵溫度的升高,總SO2和游離SO2含量都逐漸降低,游離SO2含量約為總SO2含量的2/3。這說明在較高溫度下發酵,發酵結束后要及時補加一定量的SO2,以防止被雜菌感染。在發酵溫度為10℃時發酵幾乎沒有進行,在發酵溫度為15℃和20℃時,發酵速度緩慢,但最終酒精度較高;在發酵溫度為25℃和30℃時,發酵速度較快,但最終酒精度和在15℃和20℃下發酵相比偏低。此結果說明FM-sc-08在低溫(15～20℃)下發酵可使發酵更完全、更徹底、酒精度更高。

2.3 酵母菌FW-sc-08發酵所產黑莓果酒香氣成分分析

揮發性香氣物質是葡萄酒和其他果酒的重要組成成分,是形成果酒不同風味的重要物質和果酒感官評價的重要指標[24-25]。酵母菌FM-sc-08在20℃和25℃發酵所產黑莓果酒香氣成分測定結果如表4所示。由表4可知,共檢測出44種揮發性物質,其中在20℃發酵條件下檢測出35種,在25℃發酵條件下檢測出29種,這些揮發性物質主要為醇類、酮類,醛類、酸類和酯類;與在25℃發酵相比,在20℃發酵,有30種香氣物質相對含量明顯升高,14種香氣物質相對含量下降。結果說明,與在25℃發酵相比,酵母菌FM-sc-08在20℃發酵生產黑莓酒,可產生更多的揮發性物質,使果酒風味更豐富。這可能是因為在低溫下發酵浸漬時間更長,香氣物質溶出更多且保留更多,高溫下發酵香氣成分揮發較多造成的。

表4 酵母菌FW-sc-08發酵黑莓果酒香氣成分分析Table 4 Analysis of blackberry wine aroma components fermented by S.cerevisiae FM-sc-08

續表

3 結論

本試驗對從自然發酵黑莓酒中篩選出的酵母菌FW-sc-08的生長和發酵特性進行了研究。結果顯示,酵母菌FM-sc-08對數生長期為3～9 h;在pH2.0～3.5內隨著培養基pH的降低生長逐漸變慢;其對SO2的最大耐受質量濃度為800mg/L。在黑莓酒發酵中,酵母菌FM-sc-08可發酵糖最大含量為30%,對糖的最大耐受含量為40%,發酵產酒精度最高為16.3%vol,發酵時間為6 d;最適發酵溫度為25℃。酵母菌FM-sc-08在20℃下發酵黑莓酒可產生比在25℃下發酵更多的香氣物質(35種)。這對優化黑莓酒發酵工藝、提高黑莓酒整體品質具有重要意義。

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LI Yahui,ZHOU Jianzhong*,WANG Ying,ZHU Jiana
(Institute of Farm Product Processing,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China)

S567.2

0254-5071(2017)11-0043-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.010

2017-06-07

江蘇省農業三新工程(GCSXC[2016]334);江蘇省農業科技自主創新(CX(15)1026)

李亞輝(1985-),男,助理研究員,博士,研究方向為食品發酵與生物技術。

*通訊作者:周劍忠(1965-),男,研究員,博士,研究方向為食品發酵與生物技術。