濃香型白酒夏冬兩季生產車間及大曲中霉菌與放線菌的分離純化

李 良,鄭桂朋,吳 昊,岳 智,陳茂彬,鎮 達*

(1.武漢天龍黃鶴樓酒業有限公司,湖北 咸寧 437000;2.湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室工業發酵湖北省協同創新中心 工業微生物湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430068)

濃香型白酒夏冬兩季生產車間及大曲中霉菌與放線菌的分離純化

李 良1,鄭桂朋2,吳 昊1,岳 智2,陳茂彬2,鎮 達2*

(1.武漢天龍黃鶴樓酒業有限公司,湖北 咸寧 437000;2.湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室工業發酵湖北省協同創新中心 工業微生物湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430068)

為研究湖北咸寧濃香型黃鶴樓酒霉菌和放線菌的類型和特點,采用不同的培養基,對夏季和冬季車間樣品微生物進行分離純化及形態鑒別。結果表明,夏季車間空氣中分離到15株霉菌,大曲中10株霉菌(104～105CFU/g),窖泥中1株霉菌和1株放線菌(102～103CFU/g)。冬季車間空氣中分離到9株霉菌,大曲中9株霉菌(104～105CFU/g),窖泥中7株霉菌(103～104CFU/g);窖泥霉菌菌落的氣絲少,形態與空氣及大曲中的主要霉菌差異顯著。比較冬季和夏季樣品,僅從冬季大曲的曲心和曲皮中分離到青霉,從夏季底泥中分離到一株放線菌,冬季的空氣霉菌少于夏季,而冬季窖泥中的霉菌多于夏季。

濃香型白酒;生產車間;大曲;霉菌;放線菌;分離純化

中國白酒制曲工藝為開放式,酒窖發酵又是半開放式,它與窖外生態環境關系十分密切,水質、土壤、氣候等因素無不影響到釀酒微生物區系形成。唐亞等[1]概括了中國川南地區的適宜白酒釀造的氣候特征,如溫暖、降雨量適中、濕潤、日照少、風小。楊基智等[2]對山東省威海市與中國濃香型白酒主產地宜賓、瀘州在氣候環境條件進行比較,提出改進工藝的措施。相對而言,酒廠生產車間、窖池的分布、南北朝向、空氣流通條件對窖池微生態的影響更為直接有效,張良等[3]對瀘州古釀酒作坊空氣曲霉菌進行研究,發現了多種不同曲霉,并檢測了產酶種類,說明可能對入窖酒糟產生影響,但是近年來相關的研究還非常少。

湖北黃鶴樓酒濃香型生態釀酒基地位于湖北咸寧,該地區氣候溫和、降水充沛,長江依境東流,釀酒基地占地面積48.5 hm2,釀造車間位于地表以下,常年車間內的氣溫保持在18～28℃,具有恒溫、低溫的優越條件,為建立黃鶴樓濃香型白酒獨特的產品風格打下基礎。本實驗立足于生產工藝中的車間空氣、窖泥的微生物種類及分布規律的研究,擬建立黃鶴樓酒生態洞釀車間的功能微生物菌種資源庫,總結黃鶴樓濃香型白酒獨特風味的形成機理,以期為進一步改進生產工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

空氣、大曲及窖泥樣品在5號車間當天正常生產中采集,時間為2016年9月(夏季)及2017年2月(冬季)。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextrose agar,PDA)培養基(用于真菌分離)、高鹽察氏瓊脂(saltCzapek-doxagar,SCA)培養基(用于真菌分離)、氯硝胺18%甘油瓊脂(dichloran 18%glycerol,DG18)培養基(用于真菌分離)、Isp2培養基(用于放線菌和真菌分離)、改良高氏1號(improved Gao 1,IG1)培養基(用于放線菌分離)、M1培養基(用于稀有放線菌分離):青島海博生物技術有限公司。

LB(Luria-Bertani)培養基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,氯化鈉 5 g,瓊脂20 g,水1 000 mL,pH7.0～7.2。

YEPD培養基(yeast extract peptone dextrose,YEPD):酵母膏10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,瓊脂粉20g,水1000mL,pH自然。

1.1.3 化學試劑

蛋白胨、牛肉膏和酵母膏(均為生化試劑):北京雙旋微生物培養基制品廠;葡萄糖、氯化鈉,雙乙酰、乙酸正戊酯(均為分析純)、瓊脂(生化試劑)、無水乙醇(色譜純):國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D無菌操作臺:蘇州凈化設備有限公司;AR3130電子天平:美國Ohaus公司;VORTEX-BE1振蕩器:海門市其林貝爾儀器制造有限公司;DW-HL340低溫冰箱:中科美菱低溫科技有限責任公司;CX31RTSF顯微鏡:日本Olympus公司;LDZX-75KB立式蒸汽滅菌鍋:上海申安醫療器械有限公司;ZXSD-A1270生化培養箱:上海智城分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采樣方法

空氣樣品采用LB和YEPD平板共20個,在車間各方位放置30 min。窖泥表層去除后,取窖泥樣品。樣品用自封袋密封,低溫保存,一周內完成分離純化操作。取塊狀大曲,去除表面2～3 mm層,取碎塊粉碎為曲皮樣品;從塊曲的截面挖取碎塊,粉碎后作為曲心樣品。

1.3.2 菌株的分離純化

空氣樣品用LB和YEPD平板采樣后,在30℃培養2～5d,及時挑出霉菌菌落純化。其他樣品采用稀釋分離法:準確稱取樣品10 g放至含玻珠的90 mL無菌水中分散,梯度稀釋至10-1～10-4,實際使用3個梯度,取100 mL涂布各種培養基平板各2皿,30℃培養5 d,每天及時挑取菌落至YEPD平板純化。將所有純化的平板進行比較,對每種樣品的形態完全相同的平板保留一個,對不同培養基上出現相同形態的菌落予以記錄。

1.3.3 菌株保藏

采用斜面保藏及甘油管-40℃低溫保藏。

1.3.4 菌株形態觀察

對在YEPD平板培養3天時的菌落形態拍照記錄,取菌絲及孢子在40×(霉菌)或油鏡(放線菌)鏡檢,對菌絲、子實體和孢子進行觀察并拍照。

1.3.5 發酵及產物分析

從空氣及大曲中分離的霉菌孢子分別接種到麩皮培養基中(麩皮加水,含水量50%)。在500 mL三角瓶中,30℃的有氧條件下培養制成含大量孢子的麩曲。以高粱米浸泡24 h后,清洗,瀝干至含水量50%左右,100℃蒸30 min,使淀粉糊化。糊化的高粱米冷卻后加入10%大曲粉,0.1%麩曲,充分拌勻后,裝滿1 000 mL廣口試劑瓶,以兩層聚乙烯膜封口,于25℃培養箱中發酵2周。取出酒糟適量至圓底燒瓶,加1倍體積水,用小火加熱蒸餾,取前餾出物(40%)為樣品,以高粱米和大曲粉(不加入麩曲)的發酵酒糟的餾出物樣品為對照,樣品經無水乙醇調節至體積分數為60%后,加入乙酸正戊酯作為內標,以標準雙乙酰為標樣,參照胡格等[4]的分析方法,進行氣相色譜儀分析。

1.3.6 菌種的分子生物學鑒定

基因組DNA采用液氮十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)法提取,以引物ITS1/ITS4擴增18S rDNA片段,采用3730測序儀測序,對序列進行美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)blast分析,由北京六合華大基因科技有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 夏季車間空氣中微生物分析

表1 夏季車間空氣中分離到的霉菌Table 1 Moulds isolated from air samples in summer workshop

續表

由表1可知,空氣中霉菌的菌落形態非常豐富,共分離到15株不同形態的霉菌,未分離到放線菌。夏季空氣霉菌的多樣性很強,樣品中霉菌子實體包括孢子囊(膨大,有外膜)、分生孢子梗(無膨大的頂囊,但有分枝的孢子梗,上面著生成串孢子)、分生孢子頭(有膨大的頂囊,上面著生成串孢子)及孢子座(有其他復雜的著生孢子的結構),菌絲包括有隔和無隔,甚至有卷曲狀菌絲,孢子形狀也有不常見的柱狀和鐮刀狀。其中菌株P1根據形態鑒定為青霉,其他菌株暫未確定其種屬。

2.2 夏季窖泥中微生物分析

表2 夏季窖泥中分離到的霉菌及放線菌Table 2 Moulds and actinomycetes isolated from summer mud samples

由表2可知,壁泥和底泥中僅從底泥中分離到兩種菌株,包括放線菌6P1及霉菌6D1。這兩種菌落出現在10-2稀釋度平板上,說明數量較少。

2.3 夏季大曲中微生物分析

由表3可知,從大曲皮及曲心中分離出10株霉菌,其中曲皮5株,曲心5株。從形態上劃分,主要有4種類型:一是具有孢子囊、氣絲豐富的類型,與根霉相似,但也包括有隔菌絲的類型,還有待進一步細分;二是曲霉型,具有頂囊和孢子鏈;三是具孢子囊,但是菌落氣絲很少;四是氣絲少,無頂囊而具有孢子鏈的類型。從曲皮及曲心中分離到的霉菌有相同類型,也有不同類型,但是均未分離到青霉和放線菌。

表3 夏季大曲中分離到的霉菌Table 3 Moulds isolated from summer Daqu samples

2.4 冬季洞釀車間空氣中微生物分析

根據第一批培養基的分離效果,第二批樣品采用LB及YEPD兩種平板分離車間空氣霉菌和放線菌,共獲得9株,結果見表4。由表4可知,具有近似根霉形態的菌株較多,也有一株曲霉,另外菌株L23,為長囊狀孢子囊,含內生孢子,而L24為外生孢子,但未觀察到子實體,總共有四種主要形態。沒有分離到青霉和放線菌。與2016年9月采集的樣品比較,2017年2月(冬季)的發酵車間空氣中的霉菌種類較少。

表4 冬季生產車間的空氣中分離到的霉菌Table 4 Moulds isolated from the air samples in winter workshop

2.5 冬季窖泥微生物分析

由表5可知,在窖泥中獲得7株霉菌,這些菌株形態與根霉、曲霉、青霉等常見類型不同,普遍無明顯氣絲。菌株D22具有外生孢子及膨大的頂囊,但是其孢子不是呈串生長,與曲霉差別明顯。與2016年9月的窖泥樣品比較,這次獲得的霉菌類型較多,相同之處在于,從兩批樣品中的窖泥中獲得的霉菌均無明顯氣絲。

2.6 冬季大曲微生物分析

從2017年2月這批大曲樣品中共分到9種霉菌,結果見表6。由表6可知,其中6株氣絲豐富,有孢子囊和內生孢子,與根霉相似,另有兩株與青霉相似(曲皮、曲心各一株),有一株與曲霉相似,來自曲皮。各自數量級達到104～105CFU/g。根霉類型的菌株差別在于孢子囊數量不同,以及菌絲有隔和無隔的差別,有待細分。曲心和曲皮中均分離到青霉,這與上次夏季大曲樣品不同。樣品中未分到放線菌。

2.7 不同培養基的分離效果

對2017年冬季各樣品的6種培養基分離獲得的菌株數進行統計結果見表7。由表7可知,對每個樣品而言,SCA、DG18、Isp2、M1和PDA培養基都易于生長霉菌。高鹽察氏培養基營養物豐富,即使有高鹽環境但仍然有較多霉菌生長,說明大曲中的霉菌較耐高鹽,但窖泥中的霉菌不適于該培養基。DG18培養基具有甘油高滲環境,適于曲和窖泥霉菌的生長,特別是適于窖泥中的霉菌的生長,說明窖泥霉菌較耐甘油高滲條件。窖泥霉菌的分離純化宜采用DG18而不是高鹽察氏培養基。Isp2培養基營養豐富,但是pH偏堿性(pH7.2),與DG18培養基比較,不適于曲中的霉菌生長,但適于窖泥中的霉菌生長。PDA培養基適合部分樣品的霉菌生長,本實驗中唯一獲得的一株放線菌來自PDA平板。相比而言,M1培養基適于多數樣品霉菌的生長,說明M1培養基雖然濃度過低但營養全面,如果提高營養物濃度,也許可以獲得更好的效果。改良高氏一號培養基中pH偏堿,而且加入3%重鉻酸鉀,在現有分離純化條件下未能分離到任何霉菌和放線菌。如繼續應用改良高氏一號于霉菌和放線菌的分離,需要改進方法,如減少樣品稀釋程度、去除重鉻酸鉀的加入等。

在空氣霉菌的分離中,PDA培養基上獲得的霉菌種類遠少于YEPD和LB培養基,這應該與其營養物豐富度不如后兩者有關。

表7 6種培養基分離2017冬季樣品中的菌株數Table 7 Numbers of strains isolated from 2017 samples in winter by6 kinds of media

3 討論

文獻研究表明[5],相對于細菌,濃香型白酒窖泥的真菌多樣性較低。本研究中在冬季窖泥中分離到多種霉菌,而且夏季和冬季窖泥的霉菌差異較大?？紤]到屬于不同窖池取樣,但是屬于同車間同窖齡的條件,認為季節對窖泥霉菌的數量和種類有明顯影響。本研究中從上部窖泥、下部窖泥和底泥分離到不同的種類,這些窖泥霉菌還有待做進一步鑒定,以與枝江大曲[6-7]和瀘州老窖[8]等濃香型大曲酒的窖泥真菌進行比較。另外,從窖泥中分離到一株放線菌。放線菌在濃香型白酒的窖泥中的分布和功能研究正逐步獲得企業及研究機構的關注[5,9-10],本研究獲得的一株放線菌也有待進一步鑒定。

相對于細菌和酵母,大曲中的霉菌種類相對較少[11]。梁金輝等[12]從古井濃香型酒大曲中共分離到55株細菌,43株酵母和11株霉菌,本研究從夏冬兩季的大曲中分別分離了10株和9株霉菌,與前者相似。我們特別關注的青霉菌只在冬季大曲中出現。行業中認為青霉菌的出現可能會導致異味、出酒率下降等不利現象。但是更多的文獻發現青霉屬是大曲中的常見霉菌[12-15]。

本研究分離到大量空氣霉菌,其中夏季空氣霉菌類型遠多于冬季霉菌。通過對分離到的霉菌的跟蹤分析,有可能找到典型的有益及有害霉菌,從而對生產工藝進行指導。

4 結論

黃鶴樓酒洞釀車間冬季的空氣霉菌顯著少于夏季,冬季窖泥霉菌明顯多于夏季窖泥,而兩季的大曲中霉菌種類數量相近。說明濃香型黃鶴樓酒生產車間的空氣、窖泥的霉菌數量差異較大。該結果為闡明夏季和冬季基酒質量差異的機理提供了支持。

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L
I Liang1,ZHENG Guipeng2,WU Hao1,YUE Zhi2,CHEN Maobin2,ZHEN Da2*
(1.Wuhan Pride Yellow Crane Tower Distillery Co.,Ltd.,Xianning 437000,China;2.Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology,Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation,Hubei Key Laboratory of Fermentation Engineering,Ministry of Education,School of Food and Biological Engineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

TS262.3

0254-5071(2017)11-0054-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.012

2017-08-07

科技部重點項目(2016YFD0400500)

李 良(1982-),男,工程師,碩士,主要從事酒類研究開發工作。

*通訊作者:鎮 達(1968-),男,副教授,博士,主要從事酒類發酵研究工作。