多菌種發酵辣椒汁培養基配方的優化

曾希珂,張 喻*,羅鳳蓮,王 燕

(1.湖南農業大學 食品科學技術學院,湖南 長沙 410128;2.國家蔬菜加工技術研發分中心,湖南 長沙 410128;3.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410128)

多菌種發酵辣椒汁培養基配方的優化

曾希珂1,2,3,張 喻1,2,3*,羅鳳蓮1,2,3,王 燕1,2,3

(1.湖南農業大學 食品科學技術學院,湖南 長沙 410128;2.國家蔬菜加工技術研發分中心,湖南 長沙 410128;3.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410128)

以腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)為試驗菌株,采用鮮辣椒汁為基礎培養基,通過單因素試驗確定最佳碳源、氮源和無機鹽及其添加量。在此基礎上,以上4種乳酸菌按照1∶1∶1∶1的配比混合后作為試驗菌株,采用正交試驗設計優化,多菌種發酵鮮辣椒汁培養基的配方。結果表明,最佳培養基配方為葡萄糖的添加量為4%,酵母浸膏的添加量為3%,磷酸氫二鉀的添加量為0.2%,優化后培養基中乳酸菌濃度為8.45×109CFU/mL,增殖效果良好。該研究為剁辣椒的產業化生產奠定了基礎。

多菌種;發酵鮮辣椒汁;培養基;正交試驗優化

乳酸菌是一種常見的益生菌,因其具有促進機體生長、降膽固醇和增強免疫力等特有的保健功能[1-3],在食品中的應用得到迅速發展。乳酸菌發酵食品主要包括發酵蔬菜、酸奶和發酵肉制品等,受到許多消費者的青睞[4]。目前,國內主要利用純種乳酸菌生產辣椒醬[5]、泡菜[6]等,與此同時,多菌種混合發酵生產發酵辣椒制品也受到研究者越來越多的關注。JI X等[7]研究發現,嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidlophilus)和瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)混合發酵產酸速度明顯大于自然發酵,并能提高產品的脆度及香味。楊玉新等[8]將活化好的保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、啤酒酵母及醋酸桿菌(Acetobacter aceti)按2∶2∶1的配比接入辣椒醬后,制成的產品色澤鮮紅,香味濃郁。

剁辣椒的傳統制作工藝主要是采用高鹽自然發酵,發酵周期長,易受雜菌污染從而導致亞硝酸鹽含量偏高,嚴重影響了食品的健康與安全性[9]。根據自然界的多菌群發酵原理,本研究將腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)4種乳酸菌復配后接種至新鮮辣椒汁中進行研究。并對培養基的碳源、氮源、無機鹽種類及濃度進行優化,從而確定多菌種發酵辣椒汁培養基配方的最優條件,以期為多菌種發酵劑的制備以及開發新型發酵辣椒產品提供理論依據,對于今后剁辣椒的產業化生產具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌種

紅辣椒:湘辣4號,紅色,果長15～18 cm,新鮮,無病蟲害,購于湖南農業大學東之源超市。

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ATCC-8014、腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)CICC-21861,發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)ATCC-11739,嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC-4356:廣東省微生物菌種保藏中心(GuangdongMicrobialCultureCenter,GDMCC)。

1.1.2 培養基

MRS液體培養基:酪蛋白胨10.0 g、牛肉浸取物10.0 g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸二銨2.0g、吐溫80 1.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、蒸餾水1.0 L。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、吐溫-80、乙酸鈉、瓊脂粉(均為分析純或生化試劑):國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9272A型恒溫培養箱:上海飛越實驗儀器有限公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫療器械廠;CJ-2D型凈化工作臺:天津市泰斯特儀器有限公司;CP214型電子天平:奧豪斯儀器(上海)有限公司;722S型可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化

將裝有凍干乳酸菌粉的安碚管破管,吸取0.5 mL左右的MRS液體培養基注入管中,溶解干粉,然后接種在5 mL的MRS液體培養基中,于37℃的條件下靜置培養24～48 h,連續轉管活化2～3代后,以4種乳酸菌按1∶1∶1∶1的配比、接種量5%接入MRS液體培養基,于37℃恒溫培養24 h得到發酵種子液[10]。

1.3.2 菌株生長曲線的測定

待菌株活化后,接種1 mL種子液于裝有MRS液體培養基的無菌試管中。將已接種的試管置于37℃條件下靜置培養48 h,每2 h在分光光度計波長600 nm處測定一次其OD600nm值,以空白培養基作對照。然后以OD600nm值為縱坐標,生長時間為橫坐標分別繪制4種乳酸菌的生長曲線。

1.3.3 菌濃度的測定

采用平板菌落計數法[11]進行測定。

1.3.4 鮮辣椒汁基礎培養基

原料選擇(挑選新鮮、無病蟲害的鮮辣椒)→清洗→打漿→過濾→調節碳、氮源和無機鹽(添加質量分數3%的葡萄糖作為碳源、質量分數3%的酵母浸膏作為氮源、質量分數0.2%的磷酸氫二鉀作為無機鹽)→混合溶解→調配(調節pH5～6)→滅菌(121℃滅菌20 min)→冷卻至室溫→鮮辣椒汁培養基

1.3.5 培養基成分的優化

(1)不同碳源及其添加量對乳酸菌生長的影響

在原辣椒汁培養基中,分別選擇葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖,作為其中的碳源,添加量3%,其余成分固定。以4種乳酸菌按1∶1∶1∶1的配比、接種量5%接入培養基中,于37 ℃恒溫培養24 h后測定其菌濃度,根據菌株的生長情況選擇最佳碳源。以1%、2%、3%、4%、5%等5個濃度梯度,測定不同碳源添加量對乳酸菌濃度的影響。

(2)不同氮源及其添加量對乳酸菌生長的影響

在原辣椒汁培養基中,分別選擇胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏,作為其中的氮源,添加量2%,其余成分固定。以4種乳酸菌按1∶1∶1∶1的配比、接種量5%接入培養基中,于37℃恒溫培養24 h后測定其菌濃度,根據菌株的生長情況選擇最佳氮源。以1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%5個濃度梯度,測定不同氮源添加量對不同乳酸菌濃度的影響。

(3)不同無機鹽及其添加量對乳酸菌生長的影響

在原辣椒汁培養基中,分別選擇K2HPO4、Na2HPO4、MgSO4、FeSO4,作為其中的無機鹽,添加量0.4%,其余成分固定。以4種乳酸菌按1∶1∶1∶1的配比、接種量5%接入培養基中,于37℃恒溫培養24 h后測定其菌濃度,根據菌株的生長情況選擇最佳無機鹽。以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%5個濃度梯度,測定不同無機鹽添加量對乳酸菌濃度的影響。

(4)正交試驗優化培養基配方

在碳源、氮源、無機鹽種類及添加量確定的情況下,以葡萄糖、酵母浸膏和磷酸氫二鉀的濃度為影響因素,菌濃度為評價指標,采用4種乳酸菌按1∶1∶1∶1的配比混合后作為試驗菌種,以接種量5%接入培養基中,于37℃恒溫培養24h后測定其菌濃度。設計3因素3水平L9(33)的正交試驗,優化培養基組分。正交試驗因素與水平見表1。

表1 多菌種混合發酵辣椒汁培養基配方優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for optimization of medium formula of multi-strains fermentation of pepper juice

1.3.6 數據處理方法

采用SPSS19.0數據處理軟件、EXCEL軟件進行數據處理分析。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌生長曲線的測定結果

由圖1可知,四種菌株的生長曲線類似。四種菌株基本在培養2～4 h后進入對數生長期,在對數期發酵乳桿菌和腸膜明串珠菌的生長不如植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌。植物乳桿菌、發酵乳桿菌和嗜酸乳桿菌在第12小時后進入穩定生長期,而腸膜明串珠菌在15 h后進入穩定生長期。四種菌株的生長旺盛期為2～15h,說明此時段其生長代謝旺盛,適宜接種。

圖1 不同乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of different lactic acid bacteria

2.2 最佳碳源及其添加量的確定

不同碳源葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖對乳酸菌的生長情況如圖2所示。

圖2 不同碳源對菌株生長的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on strains growth

由圖2可知,當葡萄糖作為碳源時,菌濃度最高,可達1.859×109CFU/mL,且顯著高于其他糖類作為碳源時的菌濃度(P＜0.05)。其中以乳糖為碳源時的菌濃度最低,僅為0.985×109CFU/mL。說明以葡萄糖為碳源時,乳酸菌的菌濃度較高,適宜菌株的生長。而當蔗糖、麥芽糖和乳糖作為生長碳源時,菌濃度較低,菌株生長緩慢,這可能是由于乳酸菌缺乏分解雙糖的酶,不能利用較復雜的碳水化合物,因此選擇葡萄糖為最佳碳源[12]。田菊梅等[13]比較了葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖和核糖作為碳源時對低溫混合菌增殖效果的影響,雖然都有一定的促進作用,但綜合考慮確定葡萄糖作為最佳碳源。

由圖3可知,隨著葡萄糖添加量的增加,菌濃度先增大后減小。當葡萄糖添加量為4%時,乳酸菌的菌濃度最大。繼續增加葡萄糖的添加量,菌濃度反而下降,可能是由于葡萄糖濃度過高會導致菌體失水從而無法復原,因此當葡萄糖添加量為4%時,乳酸菌生長的最好,為最佳添加量。

圖3 不同葡萄糖添加量對菌株生長的影響Fig.3 Effects of different glucose concentration on strains growth

2.3 最佳氮源及其添加量的確定

不同氮源胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏對乳酸菌的生長情況如圖4所示。

圖4 不同氮源對菌株生長的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on strains growth

由圖4可知,培養基中使用酵母浸膏為氮源時,乳酸菌菌株生長較好,菌濃度高達3.283×109CFU/mL,顯著高于其他氮源(P＜0.05)。這可能是由于酵母浸膏富含蛋白質,氨基酸和維生素等營養物質,在生長過程中給乳酸菌提供了充足的氮源和所需的微量元素,促進其生長繁殖[14-15]。胰蛋白胨和蛋白胨作為氮源時菌濃度次之,且二者相差不大。而牛肉膏作為氮源時菌濃度最低。說明單獨添加牛肉膏不利于乳酸菌的增殖,無法快速的促進菌株的生長。這與楊杰等[16]選擇0.53%的酵母粉作為綠豆乳發酵專用增殖培養基的結果類似,優化后較普通基礎培養基中的活菌數提高了8.7倍。因此選擇酵母浸膏為最佳氮源。

由圖5可知,隨著酵母浸膏添加量的增加,乳酸菌的菌濃度先增大后減小。當酵母浸膏添加量為2.5%時,菌濃度最大,活菌數最多,長勢較優。而當酵母浸膏添加量＞2.5%時,菌濃度開始下降。這與林巧[17]發現不宜使用過高濃度酵母粉。因此選擇酵母浸膏的最佳添加量為2.5%。

圖5 不同酵母浸膏添加量對菌株生長的影響Fig.5 Effects of different yeast extract concentration on strains growth

2.4 最佳無機鹽及其添加量的確定

不同無機鹽磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂和硫酸亞鐵對乳酸菌的生長情況如圖6所示。

圖6 不同無機鹽對菌株生長的影響Fig.6 Effects of different inorganic salts on strains growth

圖7 不同K2HPO4添加量對菌株生長的影響Fig.7 Effects of different K2HPO4concentration on strains growth

無機鹽是細菌增殖不可或缺的重要物質,其主要作用是能維持細胞的滲透壓,此外一些無機鹽離子還對細菌體內的酶產生激活作用,促進乳酸菌的生長代謝[18]。由圖6可知,在以磷酸氫二鉀為無機鹽的培養基中菌濃度較高,濃度為2.014 3×109CFU/mL,其次為硫酸鎂,但二者相差不明顯(P＞0.05)。說明微量元素能促進植物乳桿菌的增殖,與張瑤等[19]的研究結果類似。而磷酸氫二鈉和硫酸亞鐵對乳酸菌的增殖效果不大。因此,選擇磷酸氫二鉀為最佳無機鹽。

由圖7可知,隨著磷酸氫二鉀添加量的增加,乳酸菌濃度先增大后減小。當磷酸氫二鉀的添加量增至0.3%時,菌濃度達到最高值,為4.83×109CFU/mL。隨著磷酸氫二鉀添加量的繼續增加,乳酸菌的菌濃度逐漸下降,說明磷酸氫二鉀質量分數為0.3%時為最佳添加量。

2.5 多菌種發酵辣椒汁培養基的優化

在單因素試驗的基礎上,以4種乳酸菌按腸膜明串珠菌∶植物乳桿菌∶發酵乳桿菌∶嗜酸乳桿菌=1∶1∶1∶1的配比混合后作為試驗菌株,接種量5%接入培養基中,于37℃恒溫培養24 h后測定其菌濃度。設計3因素3水平L9(33)的正交試驗,以葡萄糖、酵母浸膏和磷酸氫二鉀的濃度為自變量,乳酸菌濃度為評價指標對培養基進行優化,正交試驗結果與分析見表2,方差分析結果見表3。

表2 多菌種混合發酵辣椒汁培養基配方優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for optimization of medium formula of multi-strains fermentation of pepper juice

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments result

由表2可知,通過計算極差值可以得出各因素對多菌種的生長影響主次順序為葡萄糖＞酵母浸膏＞磷酸氫二鉀,說明葡萄糖的添加量是影響菌濃度的主要因素,其次是酵母浸膏,而磷酸氫二鉀對菌濃度的影響最小,多菌種的最佳培養基組合為A2B3C1。在此最佳培養基條件下進行驗證試驗,得到培養基中多菌種的乳酸菌濃度為8.45×109CFU/mL。故多菌種發酵辣椒汁培養基配方的最佳組合為葡萄糖添加量4%,酵母浸膏添加量3%,磷酸氫二鉀添加量0.2%。

由表3可知,葡萄糖和酵母浸膏添加量對混合菌株的菌濃度具有顯著影響(P＜0.05),而磷酸氫二鉀添加量的影響不顯著(P＞0.05)。方差分析結果與極差分析結果一致。

3 結論

本研究以腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌和嗜酸乳桿菌為試驗菌株,辣椒汁為原料,通過單因素和正交試驗設計確定了優化后培養基的最佳配比為:葡萄糖添加量4%,酵母浸膏添加量3%,磷酸氫二鉀添加量0.2%,優化后培養基中多菌種的菌濃度為8.45×109CFU/mL,比優化前的6.3×108CFU/mL提高了一個數量級,增幅顯著,說明此培養基適用于多菌種的混合培養。

本研究選用辣椒汁作為基礎培養基,并對培養基的碳源、氮源、無機鹽種類及濃度進行了優化。不僅有效的提高了菌濃度,而且大大節約了成本,同時能夠使多菌種快速的適應發酵內環境并迅速產酸,為多菌種發酵劑培養基的進一步研究提供了理論依據,同時也為多菌種發酵辣椒的生產奠定了基礎。

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ZENG Xike1,2,3,ZHANG Yu1,2,3*,LUO Fenglian1,2,3,WANG Yan1,2,3
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.National R&D Center for Vegetable Processing,Changsha 410128,China;3.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

TS255.53

0254-5071(2017)11-0091-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.020

2017-08-15

湖南省科技重大專項子項目(2015NK1003)

曾希珂(1993-),女,碩士研究生,研究方向為農產品加工與貯藏。

*通訊作者:張 喻(1972-),女,教授,博士,研究方向為農產品加工與貯藏。