紫蘇葉對紅曲菌產(chǎn)色素和莫納可林K及抗氧化物的影響

盧紹闖,胡琳慧,馮艷麗*

(1.湖北師范大學(xué) 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室,湖北 黃石 435002;2.湖北師范大學(xué) 生物學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心,湖北 黃石 435002)

紫蘇葉對紅曲菌產(chǎn)色素和莫納可林K及抗氧化物的影響

盧紹闖1,2,胡琳慧1,2,馮艷麗1,2*

(1.湖北師范大學(xué) 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室,湖北 黃石 435002;2.湖北師范大學(xué) 生物學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心,湖北 黃石 435002)

以高產(chǎn)莫納可林K(MK)及紅曲色素(MPs)、不產(chǎn)桔霉素的叢毛紅曲菌(Monascus pilosus)MS-1為實驗菌株,優(yōu)化已有的固態(tài)發(fā)酵工藝,考察添加紫蘇葉對紅曲菌產(chǎn)MPs、MK及抗氧化物的影響。結(jié)果表明,添加10%紫蘇葉時MPs和MK的產(chǎn)量最高(P＜0.05)。添加紫蘇葉及紫蘇葉提取液均可顯著促進菌株MS-1產(chǎn)MPs和MK(P＜0.05),但兩種添加方式對菌株MS-1產(chǎn)MPs及MK的影響無顯著差異(P＞0.05)。添加紫蘇葉后色價和MK產(chǎn)量可分別達211.73 U/g和8.15 mg/g,分別為對照的1.35和1.36倍。紫蘇紅曲粗提物的DPPH清除率顯著高于對照(P＜0.05),可達48.71%。然而,紫蘇紅曲中迷迭香酸含量僅為0.032 mg/g,而紫蘇葉中迷迭香酸含量高達14.71 mg/g。添加紫蘇葉不僅可促使紅曲菌產(chǎn)MPs及MK,還可能促使紅曲菌產(chǎn)抗氧化物質(zhì),從而提高其發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力。

紫蘇葉;紅曲菌;紅曲色素;莫納可林K;抗氧化

紫蘇(Perillae frutescensL.)為唇形科(Labiate)一年生草本植物,為喜溫短日性植物。因其適應(yīng)性較強,作為多用途經(jīng)濟作物在我國已有2 000多年的栽培歷史[1]。紫蘇在我國北方主要是油用,而在南方則兼作香料和食用[2]。紫蘇的葉、莖、苞和籽均可入藥,其中紫蘇葉具有抗過敏、抗氧化、抗微生物、抗腫瘤和抗癌等功效,主要是紫蘇葉中含有大量多酚類化合物如迷迭香酸、兒茶素、芹菜素和木犀草素等[2]。另外,紫蘇葉中還含有8種人體必需氨基酸和4種微量元素,其中含量較高的為亮氨酸和天冬門氨基酸[3]。而紫蘇葉中粗蛋白的含量也高達27.8%,遠遠超過普通蔬菜的含量[4]。紅曲菌(Monascusspp.)又稱為紅曲霉,是我國重要的藥、食同源微生物。其可產(chǎn)生豐富的功能性次級代謝產(chǎn)物,如莫納可林K(monacolin K,MK)、紅曲色素(Monascus pigments,MPs)、γ-氨基丁酸、Dimerumicacid等[5-10],其中MK則具有調(diào)節(jié)血脂的功能;MPs主要用作天然著色劑;γ-氨基丁酸參與多種代謝活動,具有很高的生理活性;Dimerumic acid是一種抗氧化劑。添加紫蘇葉對紅曲菌其他代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響仍不清楚。肖翔等[11]將紫蘇葉提取物添加到紅曲菌GM075發(fā)酵培養(yǎng)基中,結(jié)果表明,添加超聲法提取的紫蘇葉提取物可顯著提高紅曲發(fā)酵產(chǎn)抗氧化活性物質(zhì)Dimerumic acid,紅曲發(fā)酵液的自由基清除活性也顯著提高。代沙[12]測定了不同紫蘇品系和不同產(chǎn)地紫蘇葉總多酚、總黃酮、總皂苷和原花青素含量,同時測定了其各自總還原能力、清除·OH、超氧陰離子以及抑制脂質(zhì)過氧化的能力;分析了其醇提物中部分單體酚類物質(zhì)組成及含量。甘鋒等[13]將紫蘇葉提取液添加至紅曲菌發(fā)酵培養(yǎng)基中,制得的抗氧化紅曲中含有多種生理活性物質(zhì),其中Dimerumic acid達到3.1 mg/g,含有紫蘇黃酮2.5 mg/g,具有很好的保健作用。

本研究以一株可高產(chǎn)MK不產(chǎn)桔霉素的叢毛紅曲菌(Monascuspilosus)MS-1為實驗菌株,以優(yōu)化后的紅曲固態(tài)發(fā)酵工藝為基礎(chǔ),考察添加紫蘇葉對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)MPs及MK的影響,并通過分析1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)清除率的方法對所制得的紫蘇紅曲的抗氧化能力進行評估。以期為紫蘇葉及紅曲的綜合利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

叢毛紅曲菌(Monascus pilosus)MS-1:中國典型培養(yǎng)物保藏中心,編號CCTCC M 2013295,由市售紅曲產(chǎn)品中分離獲得。紫蘇葉:河北楚風(fēng)中藥飲片有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

MK、迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DPPH自由基:美國Sigma公司;乙腈(色譜純)、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、冰醋酸、磷酸二氫銨、MgSO4·7H2O、氯化鈣、抗壞血酸、無水乙醇、Tris-HCl緩沖液(均為分析純):國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基[14]:將馬鈴薯去皮,稱取200 g,切成約2 cm2的小塊,放入鍋中煮沸30 min,然后用雙層紗布過濾,取其濾液加葡萄糖20 g,用蒸餾水補足至1 000 mL,自然pH,加入20 g瓊脂粉,充分攪拌,分裝至茄子瓶中,每瓶裝約120 mL。

種子培養(yǎng)基[14]:添加80 g/L葡萄糖,0.01 g/L蛋白胨,0.002 g/L磷酸二氫銨,0.000 5 g/L MgSO4·7H2O,0.000 1 g/L氯化鈣,以土豆汁代替蒸餾水定容,并將pH調(diào)至5.5。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[14]:將50 g細度為20目的物料(米粉30 g,豆粉20 g)加入250 mL三角瓶中,分別調(diào)整培養(yǎng)基含水量、乙酸含量及MgSO4·7H2O為35%、0.6%和0.004mol/kg,混勻、滅菌,冷卻。

以上培養(yǎng)基滅菌條件為121℃、20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5100 B紫外分光光度計:上海元析儀器有限公司;Agilent 1260高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀:安捷倫科技有限公司;Anke TJL-18G-C離心機:上海安亭科學(xué)儀器廠;HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱:哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;SENCO R旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器系列:上海申生科技有限公司;FD-1A-50冷凍干燥機:北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲樣品中MPs及MK的測定

紅曲樣品中MPs及MK的分析方法參考已建立的方法進行[14]。在50 mL的離心管中加入0.3 g紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物,加入10 mL體積分數(shù)為75%的乙醇溶液,超聲提取1 h,放入8 000 r/min的離心機中離心10 min,取上清液,采用分光光度法在波長505 nm處測定吸光度值,色價計算公式如下:

上述離心后的上清液,過0.22 μm濾膜后采用高效液相色譜法測定紅曲樣品中的MK。MK標(biāo)準(zhǔn)品的制備參考已發(fā)表的方法進行[15]。采用Agilent 1260進行HPLC分析。HPLC檢測條件為InertsilODS-3色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈∶水∶0.5%磷酸=(60∶37∶3,V/V),流速1 mL/min,柱溫25℃,檢測波長238 nm,進樣量20 μL。紅曲樣品中MK含量的計算公式為:

1.3.2 紫蘇葉添加量對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MPs和MK的影響

在優(yōu)化的固態(tài)培養(yǎng)基中添加紫蘇葉干粉,并分別將紫蘇葉干粉添加量調(diào)整為10%、20%、30%、40%,以不添加紫蘇葉干粉的處理為對照。在固態(tài)培養(yǎng)基中接入13%種子液(30℃培養(yǎng)36 h),在30℃條件下培養(yǎng)60 h后轉(zhuǎn)入25℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至14 d。將所得紅曲發(fā)酵產(chǎn)物在55℃烘干并粉碎至細度為80目。采用分光光度法分析上述樣品的色價,采用HPLC法分析MK的含量。

1.3.3 紫蘇葉添加方式對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MPs和MK的影響

在優(yōu)化的固態(tài)培養(yǎng)基中添加紫蘇,分別以添加紫蘇葉干粉和紫蘇浸提液(紫蘇葉干粉和水料液比1∶5(g∶mL)在60℃浸提2 h,過濾),以不添加紫蘇的處理作為對照。接種量、培養(yǎng)條件及樣品烘干方法及發(fā)酵產(chǎn)物的色價、MK含量的測定方法同1.3.2。

1.3.4 紫蘇紅曲與常規(guī)紅曲粗提物清除DPPH效果對比[16]

紫蘇紅曲提取物制備:在1 L三角瓶中按1∶10(g∶mL)料液比加入紫蘇紅曲和體積分數(shù)為80%的乙醇溶液,置于60℃恒溫水浴1 h,過濾,取上清液在80℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),所得固形物置于平皿中冷凍24 h。待冷凍完全后置于冷凍干燥機干燥約24 h得到粉末狀粗提物。

溶液的配制:Tris-HCl(pH 7.40,50 mmol/L)緩沖液,0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液,6 mg/mL樣品,用體積分數(shù)為80%的乙醇溶液溶解,維生素C(vitamin C,VC)的質(zhì)量濃度也調(diào)整至6 mg/mL[16]。

按表1加樣,混合均勻,室溫條件下放置30 min,在波長517 nm處測定吸光度值。以VC作陽性對照,按以下公式計算清除率:

表1 清除DPPH實驗加樣表Table 1 Adding sample table of clearing DPPH experiments

1.3.5 紫蘇葉及紫蘇紅曲中迷迭香酸含量的測定

紅曲樣品中迷迭香酸的提取方法同MPs及MK的提取,采用改進后的HPLC法檢測迷迭香酸的含量。采用體積分數(shù)為80%的乙醇為溶劑,將迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。HPLC系統(tǒng)同1.3.1,流動相為甲醇∶0.5%磷酸=(60∶40,V/V),流速1 mL/min,柱溫25℃,檢測波長330 nm,進樣量10 μL。迷迭香酸含量的計算公式如下:

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇葉添加量對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MPs和MK的影響

為考察紫蘇葉添加量對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MPs及MK的影響,以不添加紫蘇的處理作為對照,發(fā)酵14 d后檢測發(fā)酵產(chǎn)物的色價及MK含量,結(jié)果如圖1所示。

圖1 紫蘇葉添加量對菌株MS-1產(chǎn)MPs(A)及MK(B)產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of perilla leaf addition on MPs(A)and MK(B)production by strain MS-1

由圖1A可知,添加10%紫蘇葉后可顯著促進紅曲菌MS-1產(chǎn)MPs(P＜0.05),當(dāng)紫蘇葉添加量為10%時,色價達到120 U/g,是對照的1.74倍。當(dāng)添加20%和40%的紫蘇葉時,和對照組相比色素產(chǎn)量有所下降。而添加30%紫蘇葉的色素和對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。由圖1B可知,當(dāng)紫蘇葉添加量為10%時,對MK的產(chǎn)量也有顯著促進作用(P＜0.05),MK產(chǎn)量可達到對照的1.70倍。當(dāng)紫蘇葉添加量為20%、30%和40%時,對MK的產(chǎn)量均有顯著抑制作用(P＜0.05)。綜合考慮紫蘇葉對MPs及MK產(chǎn)量的影響,選擇添加10%的紫蘇葉開展后續(xù)實驗。

2.2 紫蘇葉添加方式對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MPs和MK的影響

為考察紫蘇葉添加方式對菌株MS-1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MPs及MK的影響,以不添加紫蘇葉的處理作為對照,發(fā)酵14 d后檢測發(fā)酵產(chǎn)物的色價及MK含量,結(jié)果如圖2所示。

圖2 紫蘇葉添加方式對菌株MS-1產(chǎn)MPs(A)及MK(B)的影響Fig.2 Effect of adding method of perilla leaf on MPs(A)and MK(B)production by strain MS-1

由圖2可知,添加10%紫蘇葉干粉和10%紫蘇葉提取液,對菌株MS-1產(chǎn)MPs和MK均有顯著促進作用(P＜0.05)。然而,兩種不同的添加方式之間并無顯著性差異(P＞0.05)。添加紫蘇葉后色價和MK產(chǎn)量可達211.73 U/g和8.15 mg/g,分別為對照的1.35和1.36倍。與“紫蘇葉添加量”批次的實驗相比,添加紫蘇葉對MPs和MK的促進作用有所減弱。可能是發(fā)酵實驗自身的不穩(wěn)定性以及不同批次菌種的活力不同造成的。但總體來說,紫蘇葉對紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MPs及MK均呈促進作用,且MK的產(chǎn)量相對穩(wěn)定。

2.3 紫蘇紅曲與常規(guī)紅曲粗提物清除DPPH效果對比

為考察添加紫蘇葉對紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物清除DPPH效果的影響,以不添加紫蘇的處理作為對照,培養(yǎng)14 d,發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)提取、過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥后得粗提物(100g紅曲樣品得到約1 g粗提物),分別測定紫蘇紅曲和常規(guī)紅曲DPPH的清除率,結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同樣品對DPPH清除率的影響Fig.3 Effect of different samples on the clearance rate of DPPH

由圖3可知,紫蘇紅曲粗提物的DPPH的清除率顯著高于對照(P＜0.05),其清除率高達48.71%。以VC作陽性對照,VC的DPPH清除率可達到76.75%。由于紫蘇紅曲和常規(guī)紅曲的粗提物中能起到抗氧化作用的組分復(fù)雜,目前已證實具有抗氧化作用的物質(zhì)除了Dimerumic acid還有紅色素和橙色素[16]。本實驗所采用的紫蘇紅曲樣品色價為對照的1.35倍,紫蘇紅曲粗提物對DPPH的清除率為常規(guī)紅曲粗提物的1.63倍。

2.4 紫蘇葉及紫蘇紅曲中迷迭香酸含量的測定

為進一步分析紫蘇紅曲與常規(guī)紅曲抗氧化能力提高的原因,采用HPLC法分析了紫蘇葉及紫蘇紅曲中迷迭香酸的含量,結(jié)果如表2所示。

表2 紫蘇葉及紫蘇紅曲中迷迭香酸含量對比Table 2 Comparison of contents of rosmarinic acid in perilla leaf and perillaMonascus

由表2可知,紫蘇葉中迷迭香酸含量遠遠大于紫蘇紅曲中迷迭香酸含量,呈現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01),紫蘇葉中迷迭香酸含量高達14.71 mg/g。根據(jù)已有文獻推測[11],在發(fā)酵過程中紅曲菌可能利用了迷迭香酸,紫蘇紅曲的抗氧化作用并非由于迷迭香酸的功能,而是紅曲菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究考察了添加紫蘇葉對紅曲菌在固態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)MPs及MK的影響,分析了常規(guī)紅曲及紫蘇紅曲的抗氧化能力和影響其抗氧化能力的原因。結(jié)果表明,在紅曲菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加紫蘇葉可顯著促進紅曲菌產(chǎn)MPs及MK,并可提升紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物清除DPPH的能力。經(jīng)分析,紫蘇紅曲中迷迭香酸含量僅為0.032 mg/g,推測紅曲菌利用了部分迷迭香酸。與對照相比,推測紫蘇紅曲表現(xiàn)出的高抗氧化能力并非是紫蘇葉主要功效成分迷迭香酸所起的作用,而是由于添加紫蘇葉促進了紅曲菌抗氧化成分如Dimerumic acid及紅曲色素等的產(chǎn)生。綜上,添加紫蘇葉不僅可促進紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MPs和MK,還可促進紅曲菌產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)。該研究結(jié)果可為新型紅曲產(chǎn)品如紫蘇紅曲的開發(fā)及紫蘇的綜合利用提供新的思路。

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LU Shaochuang1,2,HU Linhui1,2,FENG Yanli1,2*
(1.Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation and Utilization,Hubei Normal University,Huangshi 435002,China;2.National Demonstration Center for Experimental Biology Education,Hubei Normal University,Huangshi 435002,China)

TS201.3

0254-5071(2017)11-0101-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.022

2017-08-08

湖北省重點實驗室開放基金項目(EWPL2017)

盧紹闖(1993-),男,本科生,研究方向為食品生物技術(shù)。

*通訊作者:馮艷麗(1981-),女,副教授,博士,研究方向為食品微生物。