接骨木花青素的純化工藝及清除DPPH自由基活性的研究

馮文娟,崔瑋琪,徐澤平,2,陳曉慧,李超孟,董志榮,司文元,包 英

(1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司,山東 濱州 256500;2.濱州市環境微生物技術工程研究中心,山東 濱州 256500)

接骨木花青素的純化工藝及清除DPPH自由基活性的研究

馮文娟1,崔瑋琪1,徐澤平1,2,陳曉慧1,李超孟1,董志榮1,司文元1,包 英1

(1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司,山東 濱州 256500;2.濱州市環境微生物技術工程研究中心,山東 濱州 256500)

通過乙醇浸提法從接骨木鮮果和干果中提取花青素,通過膜分離技術、正己烷萃取、大孔吸附樹脂純化,從接骨木鮮果和干果中提取得到的花青素凍干粉得率分別為0.43%和1.52%,花青素含量可以達到29.32%。接骨木花青素在質量濃度為200 μg/mL時,DPPH自由基的清除率最高為89.40%,相當于維生素C的96.28%。結果表明,接骨木花青素有一定的抗氧化能力。

接骨木;花青素;大孔吸附樹脂;DPPH自由基

接骨木(Sambucus williamsiiHance),也叫公道老、扦扦活、大接骨丹等,在醫學領域的應用較為廣泛[1-2],對接骨木的研究主要集中在接骨木化學成分及總黃酮提取分離及抗氧化活性[3-4],接骨木莖枝葉及果實花青素成分分離及藥理活性[5-6]。花青素(anthocyanidin)是一種天然水溶性色素,易溶于水、甲醇、乙醇、稀堿與稀酸等極性溶劑中,具有抗氧化、抑菌、預防心血管疾病等功效[7-9],在食品、化妝品、醫藥領域的應用前景很好,花青素主要來源有黑豆、紫葡萄皮、藍莓、紫薯等[10-12],但是這些資源有限,因此開發花青素含量高的資源的意義重大。樹脂吸附法是利用大孔吸附樹脂吸附溶液中的有機物,再經一定溶劑將其洗脫下來,從而達到分離、純化、除雜等目的,由于其純化效果佳,對設備要求低,已經廣泛用于天然活性成分的分離純化,如大孔樹脂純化花青素、多糖等[13]。本研究以接骨木鮮果和干果為原料,采用乙醇溶劑法提取接骨木花青素,結合大孔吸附樹脂層析和真空冷凍干燥技術對花青素進行分離純化,并對其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基能力進行考察,探討其抗氧化能力,希望為接骨木花青素的產業化生產和產品開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

接骨木果:山東博華生態農業有限公司;標準品葡聚糖(平均分子質量5 900 Da、1.18×104Da、4.75×104Da、11.2×104Da、21.2×104Da、40.4×104Da):美國 Sigma 公司;維生素C(vitaminC,VC):天津市科密歐化學試劑有限公司;大孔吸附樹脂AB-8:天津南開和成科技有限公司;0.45 μm濾膜:上海安譜科學儀器有限公司;1 kDa的超濾膜:天津膜天膜科技股份有限公司;其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DL-6M型大型低速離心機:長沙湘儀離心機科技有限公司;LC-10AT高效液相色譜儀、UV-1700型紫外可見分光光度計:日本島津公司;FD-ID-55型真空冷凍干燥機:北京博醫康實驗儀器有限公司;PHS-3C型pH計:上海今邁生物科技有限公司;RE-5286A型旋轉蒸發儀:上海雅榮生化設備儀器有限公司;FA2004型電子天平:上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素的提取

接骨木鮮果去除枝葉,準確稱取1 kg加入到1 L體積分數為95%乙醇溶液(濃鹽酸調節pH 2～4)中室溫浸提4 h,4層紗布過濾,濾渣再次重復提取一遍,合并兩次濾液,離心,上清液于60℃條件下真空蒸發,獲得花青素濃縮液。

接骨木干果去除枝條,準確稱取200 g加入到1 L體積分數為95%乙醇溶液(濃鹽酸調節pH2～4)中室溫浸提48h,4層紗布過濾,濾渣再次重復提取一遍,合并兩次濾液,離心,上清液于60℃條件下真空蒸發,獲得花青素濃縮液。

1.3.2 接骨木粗多糖的提取

按照1.3.1的方法提取得到花青素濃縮液,加入5倍體積的無水乙醇進行醇沉,抽濾,濾渣60℃烘干即得接骨木粗多糖。將濾液旋轉蒸發除去乙醇,經冷凍干燥即得接骨木花青素。接骨木多糖可以說是存在于接骨木花青素提取過程中的一種雜質,影響花青素的品質。

1.3.3 總糖的測定

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[14]。以葡萄糖質量(X)為橫坐標,吸光度值(A)為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線,結果見圖1。由圖1得到標準曲線線性回歸方程為:A=7.2208X+0.000 9,相關系數R2=0.999 9,表明二者線性關系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.3.4 多糖分子質量的測定

(1)色譜條件

兩根Shodex Ohpak SB-803HQ凝膠色譜柱(8.0 mm×300mm)串連。檢測器:示差折光檢測器;流動相:0.02%疊氮化鈉水溶液;流速:0.5 mL/min;柱溫:35℃;進樣量:20 μL。

(2)標準溶液及接骨木多糖溶液的配制

準確稱取0.050 0 g葡聚糖標準品,加流動相溶解定容至10 mL,配制成5.0 mg/mL的標準品溶液,用0.45 μm水系微孔濾膜過濾即得。

準確稱取1.00g接骨木粗多糖,加流動相溶解配制成質量濃度為10 mg/mL的溶液,用0.45 μm水系微孔濾膜過濾即得接骨木多糖溶液。

(3)標準曲線的制備

分別吸取葡聚糖標準溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖及保留時間,以保留時間為橫坐標,以重均相對分子質量的對數(logMw)為縱坐標繪制葡聚糖標準曲線。

1.3.5 大孔吸附樹脂純化花青素

(1)樹脂預處理

大孔吸附樹脂AB-8先用2倍體積的無水乙醇浸泡過夜,過濾除醇,蒸餾水清洗直至洗脫液澄清為止。再用2倍體積的4%鹽酸溶液浸泡3 h,過濾,蒸餾水清洗,直至洗脫液呈中性。用2倍體積的5%氫氧化鈉溶液浸泡3 h,過濾,蒸餾水清洗,直至洗脫液呈中性。

(2)接骨木花青素分離純化工藝

[15],將預處理好的大孔吸附樹脂裝入層析柱,連續加入按照1.3.1方法提取的接骨木花青素濃縮液以10mL/min流速進行吸附,直到層析柱最下面的樹脂變紅或變黃即為吸附完成。吸附完成后,用5倍柱體積的蒸餾水洗脫,再用3倍柱體積的35%的乙醇溶液洗脫,收集水洗脫液和醇洗脫液,60℃條件下真空濃縮,-40～50℃冷凍干燥48 h,醇洗脫下來的花青素即為純化后的花青素。

經上述乙醇提取,過濾,離心,提取液濃縮,獲得花青素濃縮液,1份用0.5倍體積的乙酸乙酯萃取油脂12 h,收集下層脫脂液體;1份用0.5倍體積的正己烷萃取油脂12 h,收集下層脫脂液體;另一份不做脫脂處理。將這3份提取液用大孔吸附樹脂純化,分別收集醇洗脫液,在60℃條件下真空濃縮,-40～50℃冷凍干燥48 h得到接骨木花青素凍干粉。1.3.6花青素含量的測定

采用pH示差法。參考文獻[16],將接骨木鮮果和干果提取的花青素凍干粉分別配制成質量濃度為0.10 mg/mL和2.0 mg/mL的溶液,取兩份各1 mL于試管中,分別加4 mL pH=1.0的14.90 g/L氯化鉀緩沖液和pH=4.5的16.40 g/L乙酸鈉緩沖液(用0.2 mol/L的鹽酸溶液調節pH值),室溫放置80min,在波長520nm和700nm處測定吸光度值。花青素含量計算公式如下:

A=(A520nm-A700nm)pH1.0-(A520nm-A700nm)pH4.5

式中:A為吸光度值;449.2為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的相對分子質量;N為稀釋倍數;V為定容體積,mL;29 600為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數;L為光程,1 cm;M為取樣量,g。

1.3.7 花青素紫外可見光光譜掃描

將接骨木花青素分別用pH 1.0的氯化鉀緩沖液和pH 4.5的乙酸鈉緩沖液配制成0.1 mg/mL的溶液,在波長250～700 nm波長紫外可見光光譜范圍內掃描。

1.3.8 清除DPPH自由基能力

準確稱取0.100 0 g花青素凍干粉配成0.10 mg/mL的花青素母溶液,再用蒸餾水稀釋成200 μg/mL、100 μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、20μg/mL的花青素待測液。以相同質量濃度的維生素C作為陽性對照。

測定方法參考文獻[17-18],取待測液2.0mL加入2.0mL的2×10-4mol/LDPPH乙醇溶液混勻,以無水乙醇為空白對照,避光反應30 min,在波長517 nm處測定吸光度值,記為A1;取待測液2.0mL加入2.0mL的無水乙醇,混勻,避光反應30min,在波長517nm處測定吸光度值,記為A2;取2.0mL的2×10-4mol/L DPPH乙醇溶液加入2.0 mL的無水乙醇,混勻,避光反應30 min,在波長517nm處測定吸光度值,記為A3。清除DPPH自由基能力計算公式如下:

2 結果與分析

2.1 多糖分子質量的測定

以保留時間(x)為橫坐標,以葡聚糖重均相對分子質量對數(y)為縱坐標,繪制葡聚糖標準曲線,結果見圖2。由圖2可知,得到葡聚糖標準曲線線性方程y=-0.251 4x+11.486,擬合系數R2=0.997,說明保留時間和重均相對分子質量的對數呈良好的線性關系。

圖2 葡聚糖分子質量標準曲線Fig.2 Standard curve of molecular mass of dextran

10 mg/mL的接骨木多糖溶液經過高效液相色譜儀分析檢測,將保留時間帶入葡聚糖標準曲線線性方程得到接骨木多糖的相對分子質量,結果見表1。

表1 接骨木多糖分子質量測定結果Table 1 Determination results of molecular mass of polysaccharide fromS.williamsii

本研究檢測接骨木粗多糖中總糖含量為9.69%。通過測定接骨木多糖分子質量的分布,選擇合適的超濾膜來除掉接骨木多糖。由表1可知,接骨木多糖的分子質量有82.24%分布在1 000 Da以上,因此采用1 000 Da的膜不僅可以將接骨木提取物中的大部分多糖除掉,還可以除掉接骨木提取物中其他大分子物質,從而起到純化花青素的效果。

2.2 花青素的分離純化

以未經過大孔吸附樹脂純化處理為空白對照,檢測接骨木花青素凍干粉中花青素含量,結果見圖3。

圖3 不同處理對花青素含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on the content of anthocyanidin

以接骨木鮮果和干果為原料得到的花青素凍干粉花青素得率分別為0.43%和1.52%。由圖3可知,大孔吸附樹脂AB-8對花青素具有很好的吸附除雜作用。純化后的花青素凍干粉中花青素含量可以達到27.74%,比未純化的花青素純度提高了27.27個百分點。水洗脫下來的花青素凍干粉中花青素含量較低,為3.65%,可以收集后再次用大孔吸附樹脂進行純化。以鮮果為原料經大孔吸附樹脂純化后的花青素凍干粉中花青素含量顯著高于干果的,因此選擇接骨木鮮果為原料進行下面的實驗。

2.3 有機溶劑萃取

檢測接骨木花青素凍干粉中花青素含量,結果見圖4。

圖4 脫脂處理對花青素含量的影響Fig.4 Effect of degreasing treatment on the content of anthocyanidin

未經過脫脂處理的花青素濃縮液中含有大量的油脂,直接使用大孔吸附樹脂進行純化,不僅影響花青素的質量,而且會降低大孔吸附樹脂的使用壽命,因此,在大孔樹脂純化之前,有必要去除花青素濃縮液中的油脂。采用有機溶劑萃取法,由圖4可知,經正己烷脫脂和大孔吸附樹脂純化后得到的花青素凍干粉中花青素含量為29.32%,均顯著高于未脫脂和乙酸乙酯脫脂處理組,并且乙酸乙酯能夠溶解于水中,正己烷不溶于水,因此選擇正己烷作為去除油脂的有機溶劑。

2.4 接骨木花青素紫外可見光光譜掃描

圖5 接骨木花青素的UV-vis光譜掃描曲線Fig.5 UV-vis spectral scanning curve of anthocyanidin from S.williamsii

由圖5可知,接骨木花青素在波長520nm和280nm處有最大吸收峰,這與參考文獻[15]的研究中矢車菊花素-3-O-葡萄糖苷標準品的光譜掃描結果一致,矢車菊花素-3-O-葡萄糖苷是眾多花青素中的一種,可以初步說明從接骨木果實中提取出來的物質中含有矢車菊花素-3-O-葡萄糖苷。

2.5 清除DPPH自由基能力

圖6 接骨木花青素對DPPH自由基清除能力Fig.6 Scavenging ability of anthocyanidin fromS.williamsii on DPPH free radical

由圖6可知,接骨木花青素對DPPH自由基具有一定的清除能力,隨著花青素質量濃度的增大,DPPH自由基清除率增大,在花青素質量濃度為200 μg/mL時,DPPH自由基的清除率最高為89.40%,相當于VC的96.28%。結果表明,接骨木花青素有一定的抗氧化能力。

3 結論

通過接骨木糖分子質量的分析,82.24%的接骨木糖的分子質量分布在1 000 Da以上,可采用1 000 Da的超濾膜除掉接骨木提取物中的大部分糖來純化花青素。

與乙酸乙酯相比,正己烷能夠更加有效的去除接骨木提取液中的油脂,提高花青素的純度,延長大孔吸附樹脂的壽命。大孔吸附樹脂AB-8能夠很好的純化接骨木花青素,經正己烷脫脂和大孔吸附樹脂純化后得到的花青素凍干粉中花青素含量可以達到29.32%,比未純化的花青素純度提高了28.85個百分點。

接骨木花青素對DPPH自由基具有一定的清除能力,在花青素質量濃度為200 μg/mL時,DPPH自由基的清除率最高為89.40%,相當于VC的96.28%。結果表明,接骨木花青素有一定的抗氧化能力。

本研究的膜分離技術、正己烷萃取脫脂和大孔吸附樹脂純化,可以顯著提高接骨木花青素的純度,希望為接骨木花青素的工業化生產提供理論依據。

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FENG Wenjuan1,CUI Weiqi1,XU Zeping1,2,CHEN Xiaohui1,LI Chaomeng1,DONG Zhirong1,SI Wenyuan1,BAO Ying1
(1.Yellow River Delta Jingbo Research Institute of Chemical Industry Co.,Ltd.,Binzhou 256500,China;2.Binzhou Environmental Microbial Technology and Engineering Research Center,Binzhou 256500,China)

TS255.1

0254-5071(2017)11-0134-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.029

2017-08-24

山東省科技重大專項(2015ZDJS03003)

馮文娟(1986-),女,工程師,碩士,研究方向為農產深加工。