蘋果酒優(yōu)良酵母菌劑的制備

趙娟娟,吳榮榮,李 琳

(1.衡水學(xué)院 生命科學(xué)系,河北 衡水 053000;2.衡水市疾病預(yù)防控制中心,河北 衡水 053000)

蘋果酒優(yōu)良酵母菌劑的制備

趙娟娟1,吳榮榮1,李 琳2

(1.衡水學(xué)院 生命科學(xué)系,河北 衡水 053000;2.衡水市疾病預(yù)防控制中心,河北 衡水 053000)

該研究對(duì)制備蘋果酒菌劑的培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件以及冷凍保護(hù)劑配方進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,最適的培養(yǎng)基組成為在YPD基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,加入葡萄糖2.5%,KNO31.5%,MgSO40.1%。菌劑最適培養(yǎng)條件為:發(fā)酵溫度20℃,接種量1.0%,培養(yǎng)時(shí)間為14 h,pH5.0。保護(hù)劑為脫脂奶粉12%,甘油2%,谷氨酸鈉1%,吐溫80為0.5%。在此最佳條件下,冷凍干燥后菌劑的活菌數(shù)能達(dá)到6.12×1011CFU/g。

釀酒酵母;培養(yǎng)基;培養(yǎng)條件;冷凍保護(hù)劑

蘋果酒又叫西打酒(cider),是一類以純果汁為原料發(fā)酵而成的低度飲料酒。蘋果酒產(chǎn)量?jī)H次于葡萄酒,為世界第二大果酒,是國(guó)際飲料酒市場(chǎng)的一大熱點(diǎn)[1]。它處于果汁與酒的過度狀態(tài),有蘋果的果香和果酒的醇香,還可使大量非商品蘋果轉(zhuǎn)化增值,符合飲料酒的未來發(fā)展方向。同時(shí)蘋果酒富含多種維生素、氨基酸、鈣、鐵、鉀等營(yíng)養(yǎng)成分,以及其他酒類所沒有的蘋果酸、丙酮酸等有機(jī)酸。經(jīng)常飲用蘋果酒能降低血脂、軟化血管、促進(jìn)人體新陳代謝,還具有美容功效[2-4]。

在我國(guó)缺少專用蘋果酒發(fā)酵酵母是制約蘋果酒發(fā)展的一個(gè)重要方面。現(xiàn)在蘋果酒生產(chǎn)中大多使用葡萄酒酵母,葡萄酒酵母的特性是為適應(yīng)葡萄酒的生產(chǎn)而研發(fā)的,在蘋果酒生產(chǎn)中,并不很適宜。用發(fā)酵能力好,繁殖能力高、抗二氧化硫的酵母啟動(dòng)發(fā)酵,可以提高發(fā)酵速率,釀造出的蘋果酒具有較好的品質(zhì)[5-7]。因此,選擇起酵迅速、降糖和沉降性能好、產(chǎn)酒量大、酒香協(xié)調(diào)高品質(zhì)的蘋果酒釀酒酵母很有必要[8]。

本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的蘋果酒專用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Z1菌劑的制備關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行研究,主要從菌株生長(zhǎng)培養(yǎng)基的組成[9-11],發(fā)酵條件[12-14]以及冷凍干燥保護(hù)劑幾個(gè)方面進(jìn)行研究[15-17],以釀酒酵母的生長(zhǎng)情況為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,以期能制備工業(yè)化生產(chǎn)用的蘋果酒專用酵母,獲得高數(shù)量和活性的釀酒酵母菌劑,促進(jìn)蘋果酒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株:衡水學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏的蘋果酒專用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Z1。培養(yǎng)基:酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose,YPD),蛋白胨10 g,萄萄糖20 g,蒸餾水1 L,酵母膏10 g,121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái):上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;TU-1901紫外-可見分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;PHB-4便攜式pH計(jì):上海三信儀表廠;MLS-3750高壓蒸汽滅菌器:日本三洋集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

(1)單因素試驗(yàn)

將酵母菌接入不同碳源(葡萄糖,蔗糖、淀粉、玉米粉)、氮源(蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鉀)、無機(jī)鹽(硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鋅)的培養(yǎng)基,28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,通過對(duì)吸光度值的測(cè)定,確定最佳培養(yǎng)基組成。

(2)正交試驗(yàn)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[10-11],以葡萄糖為碳源、添加無機(jī)氮源硝酸鉀,無機(jī)鹽硫酸鎂為評(píng)價(jià)因素,采用4因素3水平的L9(34)正交試驗(yàn),在YPD基礎(chǔ)培養(yǎng)基中設(shè)計(jì)發(fā)酵試驗(yàn),確定培養(yǎng)基的最佳組成。

表1 培養(yǎng)基配方條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium formula optimization

1.3.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

(1)單因素試驗(yàn)

通過對(duì)在不同溫度(10℃、15℃、20℃、25℃)、pH(4.0、4.5、5.0、5.5)、接種量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)和培養(yǎng)時(shí)間(7 h、11 h、14 h、18 h、22 h、24 h)條件下,進(jìn)行發(fā)酵液OD560nm的測(cè)定,確定最佳培養(yǎng)條件。

(2)正交試驗(yàn)

采用4因素3水平的L9(34)正交試驗(yàn),以發(fā)酵溫度、pH、接種量,培養(yǎng)時(shí)間為考核因素,發(fā)酵液OD560nm為評(píng)價(jià)指標(biāo),確定最佳培養(yǎng)條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.3 冷凍保護(hù)劑組成的優(yōu)化

表3 冷凍保護(hù)劑配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiments for cryoprotectant formula optimization

將菌液預(yù)冷至-40℃維持2 h,然后將溫度上升至-10℃維持2 h,解除降溫措施,繼續(xù)在真空狀態(tài)下維持18 h。以脫脂奶粉、甘油、谷氨酸鈉和吐溫80添加量為考核因素,活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用4因素3水平的L9(34)正交試驗(yàn)。確定冷凍保護(hù)劑對(duì)酵母Z1的影響[16-17],因素與水平見表3。

1.3.4 活菌數(shù)測(cè)定

按“GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》規(guī)定執(zhí)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

(1)碳源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖,分別以等量的蔗糖、淀粉、玉米粉替換,按接種量2%接入菌株Z1,在28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,測(cè)得波長(zhǎng)560 nm處的OD560nm值如圖1所示。

圖1 碳源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of carbon sources onSaccharomyces cerevisiae growth

酵母菌營(yíng)養(yǎng)方式屬于化能異養(yǎng)型微生物,能夠直接吸收利用多種單糖分子。由圖1可知,菌株Z1在碳源為葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的最好,其次為蔗糖、淀粉,在玉米粉中生長(zhǎng)的最差。因此,選擇葡萄糖為最適碳源。

(2)氮源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

YPD培養(yǎng)基中的蛋白胨分別以尿素、硫酸銨和硝酸鉀代替,按接種量2%接入菌株Z1,在28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,測(cè)得波長(zhǎng)560 nm處的OD560nm值如圖2所示。

圖2 氮源對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources onSaccharomyces cerevisiaegrowth

由圖2可以看出,菌株Z1在氮源為硝酸鉀及硫酸銨的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相當(dāng),OD值較高分別為1.05和1.03,菌株的生長(zhǎng)量大。其次為蛋白胨,在尿素中生長(zhǎng)量最少。因此,選擇硝酸鉀為最適氮源。

(3)無機(jī)鹽對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

YPD培養(yǎng)基中的MgSO4·7H2O分別用硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鋅代替,按接種量2%接入菌株Z1,在28℃、120r/min振蕩培養(yǎng)24 h,測(cè)得波長(zhǎng)560 nm處的OD560nm值如圖3所示。

圖3 無機(jī)鹽對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of inorganic salt onSaccharomyces cerevisiaegrowth

由圖3可以看出,菌株在無機(jī)鹽為MgSO4和FeSO4的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的最好,OD560nm值分別為0.674、0.663,其次為MnSO4,在ZnSO4中長(zhǎng)成情況最差,OD560nm值為0.329。因此,選擇硫酸鎂為最適無機(jī)鹽。

2.1.2 培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

菌株Z1的培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 培養(yǎng)基配方條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization

由表4可以看出,葡萄糖影響較大,其次為無機(jī)鹽,硝酸鉀的影響最小。實(shí)驗(yàn)最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為8號(hào)組合,OD560nm值為0.157,極差分析結(jié)果為A3B3C2。按A3B3C2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果3次平行測(cè)定的OD560nm值為0.145,低于8號(hào)組合。因此培養(yǎng)基成分的最佳組合為碳源2.5%、氮源1.5%、無機(jī)鹽0.1%。

2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

(1)發(fā)酵溫度對(duì)酵母的影響

將菌株Z1按3%接種量接入YPD液體培養(yǎng)基中,分別在10℃、15℃、20℃和25℃條件下,120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,波長(zhǎng)560 nm下測(cè)定OD560nm值,試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature onSaccharomyces cerevisiaegrowth

發(fā)酵溫度是酵母菌最為敏感的因素之一。由圖4可知,菌株Z1的培養(yǎng)溫度從10℃到20℃隨著溫度的升高,生長(zhǎng)量增加,在20℃時(shí),達(dá)到最大值0.898。隨后隨著溫度的升高,生長(zhǎng)量開始下降。且在低溫條件下,酵母發(fā)酵平穩(wěn),不進(jìn)入明顯的旺盛發(fā)酵階段,雖發(fā)酵周期長(zhǎng),但可以使許多構(gòu)成蘋果酒特殊的風(fēng)味物質(zhì)得以最大程度的保存。所以發(fā)酵溫度選擇20℃。

(2)生長(zhǎng)pH對(duì)酵母的影響

將菌株Z1按3%接種量接入YPD液體培養(yǎng)基中,分別在不同pH值4.0、4.5、5.0和5.5,28℃條件下,120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,波長(zhǎng)560 nm下測(cè)定OD560nm值,試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 pH值對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of pH value onSaccharomyces cerevisiaegrowth

由圖5可知,隨著發(fā)酵液pH的逐漸升高,菌體密度逐步升高,在pH為4.5時(shí)菌體吸光度值達(dá)到峰值為0.88,菌株具有較高的生長(zhǎng)表達(dá)量,然后隨著pH的繼續(xù)升高,生長(zhǎng)量下降。所以選擇菌株Z1的最適pH值為4.5。

(3)接種量對(duì)酵母的影響

將菌株Z1按1.0%、1.5%、2.0%、2.5%接種量分別接入YPD液體培養(yǎng)基中,在28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h后,波長(zhǎng)560 nm下測(cè)吸光度值,試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 接種量對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of inoculum onSaccharomyces cerevisiaegrowth

由圖6可知,菌株Z1最適接種量為1.5%,OD560nm值為0.849,后隨著接種量的增加,菌株生長(zhǎng)量減小,OD560nm值下降。接種量適當(dāng),酵母菌生長(zhǎng)良好。從經(jīng)濟(jì)效益上看,接種量為1.5%對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響既經(jīng)濟(jì),又實(shí)用。

(4)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母的影響

將菌株Z1按3%接種量接入YPD液體培養(yǎng)基中,在28℃、120 r/min條件下分別振蕩培養(yǎng)7 h、11 h、14 h、18 h、22 h和24 h后,波長(zhǎng)560 nm下測(cè)吸光度值,試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of culture time onSaccharomyces cerevisiaegrowth

由圖7可知,菌株Z1生長(zhǎng)較快,在培養(yǎng)7 h后就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體密度急劇上升,14～18 h后菌株處于穩(wěn)定期,其吸光度值最大達(dá)到0.975,22 h后菌株逐漸進(jìn)入衰亡期,吸光度值逐漸降低。菌株Z1在14～18 h時(shí)菌體密度最高。

2.2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

菌株Z1的發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表5,方差分析見表6。

表5 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for culture conditions optimization

表6 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal tests results for culture conditions optimization

由表5、表6可知,培養(yǎng)溫度對(duì)OD560nm值影響最大,其次是培養(yǎng)時(shí)間,pH和接種量的影響較小。方差分析結(jié)果顯示,在95%的置信區(qū)間內(nèi),溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)OD560nm值影響顯著(P＜0.05)。其最佳培養(yǎng)參數(shù)為4號(hào)組合,OD560nm值達(dá)到1.22,極差分析最優(yōu)組合為A2B3C2D3。按A2B3C2D3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),3次平行測(cè)定的OD560nm值為1.17,小于4號(hào)組合。因此培養(yǎng)條件的最佳組合為溫度20℃、接種量1.0%、培養(yǎng)時(shí)間14 h、pH5.0。

2.3 冷凍保護(hù)劑的優(yōu)化

以脫脂奶粉、甘油、谷氨酸鈉和吐溫80為評(píng)價(jià)因素,采用4因素3水平的L9(34)正交試驗(yàn),確定冷凍保護(hù)劑對(duì)菌株生物量的影響,正交試驗(yàn)結(jié)果見表7。

由表7可知,谷氨酸鈉對(duì)活菌數(shù)影響最大,其次是甘油和脫脂奶粉,吐溫80的影響最小。其最佳參數(shù)為1號(hào)組合,其活菌數(shù)為6.12×1011CFU/g,極差分析最優(yōu)組合為A3B1C1D1。按A3B1C1D1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果活菌數(shù)為5.82×1011CFU/g,低于1號(hào)組合,因此保護(hù)劑的最佳組合為脫脂奶粉12%、甘油2%、谷氨酸鈉1%和吐溫80為0.5%。

表7 保護(hù)劑配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal tests for cryoprotectant formula optimization

3 結(jié)論

通過單因素及正交試驗(yàn),確定了蘋果酒釀酒酵母Z1在發(fā)酵過程中最適宜的培養(yǎng)基組成為碳源-葡萄糖2.5%,氮源-硝酸鉀1.5%,無機(jī)鹽-硫酸鎂0.1%,最適培養(yǎng)條件為溫度20℃、接種量1.0%、培養(yǎng)時(shí)間14 h、pH5.0。保護(hù)劑為脫脂奶粉12%、甘油2%、谷氨酸鈉1%和吐溫80為0.5%。冷凍干燥后菌劑的活菌數(shù)達(dá)到6.12×1011CFU/g。

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ZHAO Juanjuan1,WU Rongrong1,LI Lin2
(1.Department of Life Science,Hengshui University,Hengshui 053000,China;2.Hengshui Center for Disease Control and Prevention,Hengshui 053000,China)

TS261

0254-5071(2017)11-0138-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.030

2017-05-09

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(13213002)

趙娟娟(1982-),女,講師,碩士,研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵。