超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜快速測定白酒中5種天然甜味物質

趙振宇,劉 松,江 鋒,汪地強*

(貴州茅臺酒股份有限公司,貴州 仁懷 564501)

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜快速測定白酒中5種天然甜味物質

趙振宇,劉 松,江 鋒,汪地強*

(貴州茅臺酒股份有限公司,貴州 仁懷 564501)

建立利用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(UPLC-Q/Orbitrap MS)快速測定白酒中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖等5種天然甜味物質的分析方法。樣品經蒸餾水稀釋一定倍數后,過0.22 μm微孔濾膜,直接進樣分析檢測。以Polaris NH2色譜柱為分析柱,乙腈-5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液為流動相進行梯度洗脫分離,在電噴霧電離源負離子模式下進行檢測。結果表明,5種天然甜味物質在0.2～100.0 mg/L的范圍內線性關系良好(相關系數R＞0.996),基質加標回收率范圍為86.9%～105.4%,相對標準偏差(RSD)為0.5%～10.8%,檢出限為0.05～0.12 mg/L。該方法前處理簡單,測定快速、準確、靈敏度高,非常適合白酒中這5種天然甜味物質的快速篩查和定量分析。

白酒;超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜;天然甜味物質;快速測定

白酒大曲、酒醅在發酵過程中,原料淀粉被微生物分解為葡萄糖等糖類[1-2],在蒸餾過程中,部分糖類可能因共沸等原因帶入白酒中成為重要的風味物質,周雅璇等[3-4]發現白酒中有微量的葡萄糖,但未見有關其他糖類的研究報道。白酒中糖類物質能夠增強白酒的柔和度、掩蓋白酒中的不愉悅味道,但部分不良白酒生產企業利用糖類物質在白酒中的作用,達到以次充好的目的,在白酒中違規添加甜味物質[5]。

白酒中甜味物質的研究主要集中在人工合成甜味劑上[6-8],近些年國家食品藥品監督管理總局發布的酒類監督抽檢不合格產品信息中,違規使用人工甜味劑是最常見不合格項之一,但是對甜度較低的糖類物質的監管處于空白,且目前白酒中有關單、雙糖的研究在國內未見報道。本研究在高效液相色譜及液質聯用法測定單、雙糖的基礎上[9-14],采用高分辨質譜,以期建立一種能同時、快速、準確測定白酒中痕量葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

白酒:市售;乙腈(色譜級):美國化學學會;乙酸銨(色譜級)、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖(標準品):美國Sigma公司;所有實驗用水都為超純水。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜(ultra performance liquid chromatography-quadrupole/elec-trostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry,UPLC-Q/OrbitrapMS)聯用儀:美國ThermoFisherScientific公司;默克Milli-Q Advantage A10超純水系統:美國MilliporeMilli-Q公司;N-EVAP-24氮吹儀:美國OA-SYS公司;AllegraX-22系列多功能臺式高速離心機:美國貝克曼公司;ME104E分析天平:梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

移取0.1mL酒樣至5.0mL離心管中,加水定容至2.0mL,漩渦振蕩5 min后,在4℃、10 000 r/min條件下離心5 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜后進樣分析。

1.3.2 色譜條件

進樣體積5.0μL;色譜柱:PolarisNH2(2.1mm×150mm,3.5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:乙腈-5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液;流速0.3 mL/min;線性梯度洗脫,洗脫程序見表1,整個分析流程17 min。

表1 線性洗脫程序Table 1 Linear elution program

1.3.3 質譜條件

質譜條件:離子源采用加熱電噴霧電離源(electrospray ionization,ESI);吹掃氣:45 arb;鞘氣:15 arb;反吹氣:0 arb;電離電壓:-3.0 kV;離子傳輸管溫度:350℃;離子源溫度:240℃;負離子模式監測,采用full MS-TargetMS2掃描方式測定,掃描范圍50～370m/z,fullMS掃描的分辨率為70000,Target MS2掃描模式分辨率為17 500。

1.3.4 標準溶液配制

葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖分別準確稱取0.1000g至100.0 mL容量瓶中,用超純水定容至100.0 mL,得到質量濃度為1.0g/L的標準儲備液,分別精密量取上述5種標準儲備溶液適量,置10.0 mL容量瓶中,加水定容,配制成質量濃度為0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L的混合標準品工作液。

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件的優化

5種天然甜味物質中,葡萄糖與果糖,蔗糖、麥芽糖與乳糖分別是同分異構的單糖和雙糖,分子質量完全一樣,結構相似,它們的二級特征碎片也有極高的相似度,因此用質譜分別檢測5種天然甜味物質含量的前提是實現其在液相部分的完全分離[15]。實驗中考察了乙腈-乙酸銨溶液體系和甲醇-乙酸銨溶液體系的流動相,發現在甲醇-乙酸銨溶液體系中,5種化合物不能完全分離,而乙腈-乙酸銨溶液體系能較好的將5種化合物洗脫分離。同時發現為乙腈起始濃度低于75%時,果糖與葡萄糖無法分離,當乙腈起始濃度高于85%時,5種化合物的分離時間延長,且蔗糖、麥芽糖、乳糖的響應較差。

2.2 質譜條件的優化

利用流動注射的方式對5種化合物進樣分析,優化離子源電壓、溫度、鞘氣、輔助氣、吹掃氣、脫溶劑溫度等參數,得到5種化合物的母離子均為分子離子峰[M-H]-,5種化合物的總離子流色譜圖見圖1,各物質的特征離子、碰撞能量見表2。

圖1 5種天然甜味物質質譜圖Fig.1 Mass spectrum of 5 natural sweeteners

表2 5種天然甜味物質離子對及碰撞能量Table 2 Ion pairs and collision energy of 5 natural sweeteners

2.3 樣品前處理

考慮到乙醇對5種化合物檢測結果的影響,采取3種樣品前處理方式進行比較。用水將樣品稀釋到酒精度10%vol后過0.22μm濾膜后進樣分析;酒樣加熱氮吹除醇后0.22μm濾膜后進樣分析;酒樣稀釋至酒精度＜5%vol后過0.22 μm濾膜后進樣分析。3種方法對比發現,乙醇對5種天然甜味物質的回收率及其峰型有嚴重的影響。向仲朝[15]也得出過同樣的結論,在酒精度10%vol時,樣品的回收率較差,低濃度加標樣品回收率＜72.1%,高濃度加標樣品回收率＞140.5%,而在酒精度＜5%vol時,檢測結果較為滿意。采用加熱氮吹除醇處理的方法的穩定性較差,在10.0 mg/L加標水平上,回收率可以達到184.1%,而在100.0 mg/L加標水平上,回收率僅為44.1%。故最終選擇酒樣稀釋至酒精度＜5%vol的方法。

2.4 標準曲線及方法檢出限

將濃度范圍為0.2～100.0 mg/L系列的混合標準工作液,分別在Q-Exactive儀器上進行測定,以峰面積為Y軸,質量濃度為X軸,得到線性回歸方程。對空白樣品進行加標實驗,根據檢出限為基線噪音的10倍的方法測定方法檢出限,結果見表3。

表3 五種天然甜味物質的線性方程、相關系數和檢出限Table 3 Linear equations,correlation coefficients and detection limit of 5 natural sweeteners

2.5 加標回收率試驗

在上述實驗條件下,對樣品進行加標回收試驗,加標質量濃度分別為10.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L,結果見表4。

表4 五種化合物的加標回收率試驗結果Table 4 Recovery rates tests results of 5 natural sweeteners

由表4可知,果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的平均回收率分別為86.9%～101.2%、87.3%～90.8%、87.2%～105.4%、89.8%～100.0%、89.1%～103.1%,相對標準偏差(relative standarddeviation,RSD)分別為1.3%～10.8%、1.9%～10.3%、2.0%～5.2%、0.5%～5.3%、1.4%～4.0%,表明該方法準確度較好。

2.6 市售白酒樣品的測定

選擇市售的10款白酒樣品(編號A～J,包含固態法白酒和液態法白酒),按照1.3部分的方法制備樣品待測液,在儀器上檢測,每種樣品取2份平行測試,樣品中5種天然甜味物質的含量見表5。

表5 市售白酒中五種天然甜味物質的含量Table 5 Contents of 5 natural sweeteners in commercialBaijiu

由表5可知,無論是固態法白酒還是液態法白酒,均有痕量的天然甜味物質檢出,周雅璇等[3-4]同樣發現白酒中有葡萄糖存在,可能是釀酒原料在發酵過程中產生了天然甜味物質,在白酒蒸餾過程中共沸帶出進入白酒中。但是表5中部分白酒中有大量的天然甜味物質檢出,有人為添加的嫌疑,需進一步對同類酒樣進行篩查后確定。

3 結論

本研究建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法(UPLC-Q/Orbitrap MS)同時檢測白酒中5種痕量甜味物質的方法。樣品經過稀釋定容,高速冷凍離心后過濾處理,以乙腈-5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液為流動相梯度洗脫,采用Polaris NH2色譜柱分離,在負離子監測模式下進入高分辨質譜進行分析。結果表明,果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖在0.2～100 mg/L質量濃度范圍內,線性關系良好,R2＞0.996,平均回收率分別為86.9%～101.2%、87.3%～90.8%、87.2%～105.4%、89.8%～100.0%、89.1%～103.1%,相對標準偏差(RSD)分別為1.3%～10.8%、1.9%～10.3%、2.0%～5.2%、0.5%～5.3%、1.4%～4.0%。本方法系首次運用高分辨質譜檢測白酒中的天然甜味物質,具有專屬性強、前處理簡單、準確可靠、靈敏度高、重復性好等優點。

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ZHAO Zhenyu,LIU Song,JIANG Feng,WANG Diqiang*
(Kweichow Moutai Co.,Ltd.,Renhuai 564501,China)

O657.7

0254-5071(2017)11-0149-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.032

2017-08-21

貴州省重大科技專項合作項目(黔科合重大專項字(2013)6009號)

趙振宇(1984-),男,工程師,本科,主要從事食品安全研究工作。

*通訊作者:汪地強(1976-),男,工程技術應用研究員,博士,主要從事食品安全研究工作。