植物乳桿菌L-YL發酵藏紅花蘆筍復合飲品的研制

劉 義,姚 朗,胡錦蓉,李平蘭*

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院,教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室,北京 100083)

植物乳桿菌L-YL發酵藏紅花蘆筍復合飲品的研制

劉 義,姚 朗,胡錦蓉,李平蘭*

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院,教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室,北京 100083)

以含多種活性成分的藏紅花、蘆筍為主要原料,采用植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)L-YL進行發酵,研制了一款益生乳酸菌發酵的藏紅花、蘆筍活菌型復合飲品。通過單因素試驗、最陡爬坡試驗、響應面試驗對發酵復合飲品配方進行優化并驗證,得出最佳配方為:藏紅花、蘆筍粉含量2.50%,酵母粉20.8 g/L,葡萄糖10.0 g/L,乙酸鈉1.5 g/L;同時測得復合飲品中植物乳桿菌L-YL活菌數可達7.50×108CFU/mL,多糖含量23.36 mg/mL,總黃酮含量為0.24 mg/mL,研制出了一款具有開發潛力的益生菌發酵復合飲品。

植物乳桿菌;蘆筍;藏紅花;復合飲品

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)屬于革蘭氏陽性細菌,多數從植物中分離得到,故命名為植物乳桿菌[1]。該菌是人體胃腸道中常見的益生菌之一,代謝可產生有機酸、細菌素、過氧化氫等多種活性物質,可維持腸道穩態,促進腸道蠕動,降低膽固醇,減少心血管疾病,緩解乳糖不耐癥并抑制腫瘤細胞的形成[2-3]。植物乳桿菌是適應力極強的微生物,常存在于發酵的水果和果汁中,并可應用于包括乳、肉、及植物在內的發酵制品中[4]。目前,植物乳桿菌還多用于飲料、益生活菌制劑、膠囊等生產,大量臨床試驗證明其安全性,同時因其可存活定植于人體胃腸道,從而發揮免疫調節、拮抗致病菌、增強機體健康等優勢,受到越來越多的關注[5-6]。在食品發酵過程中,植物乳桿菌可利用食品原料中的糖類,代謝產生乳酸,同時產生胞外多糖、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、抗菌肽等代謝產物[7]。GABA作為一種天然存在的活性物質,有調節血壓、抑制動脈硬化、改善肝臟和腎臟功能等作用[8-9]。植物乳桿菌的乳酸發酵在改善食品風味的同時,也改善了產品的營養價值,同時,由于其代謝產生的抗菌物質,可抑制雜菌從而延長產品的保質期[10]。

現代醫學研究發現,藏紅花具有治療心血管疾病及預防動脈粥樣化、治療慢性病毒性肝炎及肝硬化的作用,并具抗癌活性、抗氧化能力,可改善乙醇誘發的學習及記憶障礙和提高機體免疫功能等[11-13]。藏紅花中藏紅花多糖及西紅花苷類物質是主要的活性成分。蘆筍營養價值極高,被譽為“蔬菜中的人參”,其富含蛋白質、維生素及礦物質,以及各種生物活性物質,包括黃酮類化合物、蘆筍多糖、甾體皂甙等,具有降血脂、抗腫瘤的作用[14-15]。

本研究以課題組分離并保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)L-YL為發酵劑制備發酵藏紅花蘆筍復合飲品,通過單因素、最陡爬坡及響應面試驗對復合飲品進行優化,測定總黃酮、多糖含量并進行感官評價。本研究采用益生菌發酵藏紅花蘆筍復合飲品,飲品能夠包括藏紅花、蘆筍及植物乳桿菌三者的營養及保健功能,豐富益生菌飲品的種類,對益生乳酸菌活菌產品的研制與開發有著一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)L-YL:由本課題組分離保存。

藏紅花粉、蘆筍粉:由山西雙錦生物科技有限公司提供。葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉:西隴化工股份有限公司。

MRS培養基:北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外可見分光光度計:上海美譜達儀器有限公司;YXQ-LS-SⅡ全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器:上海博訊實業有限公司醫療設備廠;DNP-9102恒溫培養箱:上海精宏試驗設備有限公司;3K15臺式高速離心機:五洲東方科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

在無菌條件下將備用的植物乳桿菌L-YL接種到MRS培養基中,放置于培養箱中培養,在37℃條件下培養12～15 h,活化2～3代后使用。

1.3.2 發酵液的配置及接種流程

配制待發酵溶液→調節pH至6.9～7.1→離心(常溫、8 000 r/min、10 min)→滅菌(115℃、15 min)→無菌條件測pH并調節至6.3～6.5→接種植物乳桿菌L-YL(接種量1%)→置于恒溫培養箱培養(37℃、24 h)→測發酵液的OD600nm或活菌數(CFU/mL)。

1.3.3 藏紅花蘆筍復合飲品種子培養基優化試驗設計

將活化三代以上的植物乳桿菌L-YL接種于藏紅花、蘆筍復合液中,37℃發酵24 h,測定菌株L-YL的活菌數,并以活菌數為響應值,首先進行藏紅花、蘆筍粉原料適應性評價,進一步采用單因素及最陡爬坡試驗確定關鍵因素的水平范圍,以復合飲品OD600nm值(Y)為響應值,用Design Expert 8.0軟件進行旋轉中心組合設計,并進行結果分析,得到二次線性回歸方程,預測最優配方并驗證。

1.3.4 復合飲品的指標檢測

植物乳桿菌L-YL活菌數量檢測采用傾注法平板計數;pH值:用pH計直接測量;多糖含量:采用苯酚-濃硫酸法[16];總黃酮含量:采用分光光度法[17]。

2 結果與分析

2.1 藏紅花粉、蘆筍粉原料適應性評價

將植物乳桿菌L-YL以1%的接種量,分別接種于質量分數為0.50%、1.00%、2.50%、5.00%的蘆筍粉、藏紅花粉溶液中,37℃發酵24 h后分別測得的發酵液活菌數如表1。

表1 接種植物乳桿菌對不同質量濃度藏紅花、蘆筍粉劑溶液活菌數的影響Table 1 Effects ofLactobacillus plantarumL-YL on viable count of saffron,asparagus solution with different concentration

蘆筍粉劑含量達5.00%時,發酵液活菌數為0.86×108CFU/mL。藏紅花粉劑含量達5.00%及以上時,發酵液活菌數可達2.55×108CFU/mL。由表1可知,雖然隨著藏紅花、蘆筍粉劑含量增加,植物乳桿菌活菌數增加;但含量在2.5%時兩者的活菌數均可接近或大于0.50×108CFU/mL,以滿足繼續優化的基本要求,同時考慮到藏紅花及蘆筍粉劑的價格,得到活菌數較高、價格適宜的發酵飲品,因此后期進行發酵時藏紅花、蘆筍粉劑的含量皆為2.50%。

2.2 單因素試驗

采用控制變量法找出每個影響因素對發酵有最大影響的最佳質量濃度,為接下來最陡爬坡試驗的設計提供依據。各選取一項對發酵液OD600nm值影響顯著(P＜0.05)且貢獻值最高的因素,即:酵母粉、葡萄糖和乙酸鈉,并選取這3個因素進行單因素試驗。

圖1 酵母粉(a)、葡萄糖(b)及乙酸鈉(c)對發酵液OD600nm值影響的試驗結果Fig.1 Effects of yeast powder(a),glucose(b)and sodium acetate(c)on OD600nmvalue of the fermentation liquid

由圖1數據可知,隨著酵母粉、葡萄糖及乙酸鈉添加量的增加,OD600nm值都呈先增加后下降的趨勢,酵母粉添加量為20 g/L時,發酵液OD600nm值最大為1.064,但當發酵液中酵母粉添加量上升至30 g/L時,OD600nm值下降;在發酵液中添加不同含量的葡萄糖時,OD600nm值也有一定的變化趨勢,其中葡萄糖含量為8 g/L的添加量下,發酵液OD600nm值最大為0.585,之后OD600nm值下降;將乙酸鈉單因素試驗的含量范圍控制在0～6g/L時,在1.0g/L得到OD600nm值最大為1.410,之后OD600nm值下降。通過單因素試驗得到發酵液中酵母粉、葡萄糖及乙酸鈉的最適添加量分別為20g/L、10g/L、1.0g/L。

2.3 最陡爬坡試驗

根據單因素試驗的結果,將3種影響因素復合,以水平析因中效應值的正負確定爬坡方向,以各因素的貢獻值大小確定變化步長,設計最陡爬坡試驗,從而逼近響應面擬合方程考察緊鄰區域的最佳值域,建立可靠的響應面擬合方程,得到優勢配方。

根據2水平析因設計的試驗結果,酵母粉、葡萄糖的對效應值(OD600nm)產生正效應,因此濃度變化由遞增,乙酸鈉的對效應值(OD600nm)產生負效應,因此濃度變化由遞減。試驗設計及結果如表2所示。根據試驗結果,編號3的試驗組出現的最高點,即選擇酵母粉21 g/L、葡萄糖8 g/L、乙酸鈉1.5 g/L作為旋轉中心組合設計的中心點。

表2 最陡爬坡試驗設計及結果Table 2 Design and results of the steepest ascent test

2.4 響應面試驗設計

根據2水平析因設計結果確定的水平,以及單因素試驗、最陡爬坡試驗確定的中心點的各因素水平,設計旋轉中心組合設計試驗對復合飲品配方進行響應面分析試驗,試驗結果見表3。

表3 飲料配方優化響應面試驗設計因素與水平Table 3 Factors and levels of response surface methodology for beverage formula optimization

根據旋轉中心組合設計的原理,進行3因素3水平的響應面優化試驗,共20個試驗點,其中中心點重復5次,結果如表4所示,方差分析如表5所示。

表4 飲料配方優化響應面試驗設計與結果Table 4 Design and results of response surface experiments for beverage formula optimization

表5 響應面試驗回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model of response surface experiments

以酵母粉質量濃度(A)、葡萄糖質量濃度(B)、乙酸鈉質量濃度(C)為響應因素,植物乳桿菌L-YL活菌數OD600nm值為響應值,利用Design Expert 8.0軟件對表4結果進行二次多元回歸擬合,得到二次多項回歸方程:

表5結果說明,所選模型P=0.000 2＜0.01,表明模型回歸極顯著,即模型的不同處理間差異顯著,說明用回歸方程描述各因子與響應值之間的關系時,其應變量與全體自變量之間的線性關系顯著,很好地反映了發酵液中植物乳桿菌L-YL的菌體密度OD600nm值與酵母粉質量濃度、葡萄糖質量濃度、乙酸鈉質量濃度的關系,該試驗方法可靠。失擬值P=0.167 6＞0.05,即失擬檢驗結果不顯著,未知因素對試驗的干擾小,試驗誤差小。R2=0.918 8,方程擬合度較好。同時方程一次項中B(葡萄糖)對OD600nm的影響為極顯著(P＜0.01),根據F值可知,3個因素對OD600nm變化影響的大小順序為B＞C＞A,即葡萄糖＞乙酸鈉＞酵母粉。

2.5 CCD試驗結果分析及飲品配方優化及驗證

圖2為兩兩因素交互作用的等高線圖和響應曲面圖,結合兩種圖形與表5方差分析,可判斷出各因素之間的交互作用。由圖2可知,三個等高線圖的等高線均為橢圓形,且響應面圖開口向下,說明響應值(OD600nm)在其范圍內存在最大值;但由方差分析中,模型P＜0.01及交互項AB、AC、BC的P＞0.05可知,在模型顯著的情況下,兩兩作用(酵母粉與葡萄糖、乙酸鈉與葡萄糖、乙酸鈉與酵母粉)皆不顯著。根據回歸模型及藏紅花粉、蘆筍粉原料適應性評價結果,預測植物乳桿菌L-YL發酵藏紅花蘆筍復合飲品的最佳配方為藏紅花、蘆筍粉質量分數2.5%、酵母粉20.84 g/L、葡萄糖9.95 g/L、乙酸鈉1.49 g/L,藏紅花蘆筍復合飲品OD600nm值為1.463。考慮到實際情況的可操作性,將復合飲品的發酵條件改為藏紅花、蘆筍粉質量分數2.5%、酵母粉20.8 g/L、葡萄糖10.0 g/L、乙酸鈉1.5 g/L時。按照此預測配方進行驗證試驗,得到藏紅花蘆筍復合飲品OD600nm值達1.432,活菌值達7.50×108CFU/mL,所得結果與預測模型值基本符合。

圖2 酵母粉、葡萄糖、乙酸鈉質量濃度交互作用對OD600nm值影響的響應面和等高線Fig.2 Response surfaces plots and contour line of effects of interaction between yeast powder,glucose and sodium acetate concentration on OD600nmvalue

2.6 對優化后的發酵復合飲品的評價

優化后發酵復合飲品的各項指標結果如表6所示。

表6 發酵前后復合飲品的指標Table 6 Indexes of compound beverage before and after fermentation

根據發酵前后復合飲品的各項指標變化,可以看出因發酵過程中植物乳桿菌產酸,發酵后酸度增加;發酵終點活菌數可達108CFU/mL以上,符合活菌飲料的活菌數要求。同時藏紅花、蘆筍中含有一定的多糖及黃酮,經植物乳桿菌發酵后兩者皆有增加,最終含量分別為23.63 mg/mL、0.24 mg/mL。

2.7 討論

含有益生菌乳酸菌的制品中益生菌濃度只有在大于106CFU/mL時才能發揮其益生功效[18]。XIAO Y等[19]以植物乳桿菌B1-6發酵大豆乳清,24 h后活菌數最高可達2.5×108CFU/mL;EMAMIFAR A等[20]發酵橙汁的研究中,植物乳桿菌A7活菌數為3.16×108CFU/mL;本研究通過優化最終得到的植物乳桿菌L-YL發酵藏紅花蘆筍復合飲品活菌數為7.50×108CFU/mL,相較其他植物乳桿菌發酵產品活菌數較高,具有開發潛力。

藏紅花蘆筍混合液經植物乳桿菌L-YL發酵后,發酵液中的活性物質,如總黃酮和多糖含量都有增加。其中,發酵前后總黃酮含量由0.16 mg/mL增加至0.24 mg/mL,總黃酮增長49.6%;KIM D S等[21]對植物乳桿菌發酵葛根的研究中也發現發酵后樣品總黃酮含量發生變化,增長24.3%。同時發酵前后復合飲品的多糖含量也略有增加,由19.93mg/mL增加至23.63 mg/mL;王路等[22]利用嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌研制玫瑰花發酵飲品,發現發酵后的多糖濃度略大于發酵前,分析可能是隨著乳酸菌的發酵產生大量乳酸使體系酸度增加,而酸度的增加有利于藏紅花及蘆筍多糖的溶出。

3 結論

本研究主要通過響應面等試驗對植物乳桿菌L-YL發酵復合飲品配方進行優化,得到配方為藏紅花、蘆筍粉含量2.5%,酵母粉20.8 g/L,葡萄糖10.0 g/L,乙酸鈉1.5 g/L,使發酵藏紅花蘆筍復合飲品中活菌數達7.50×108CFU/mL,并提高多糖、黃酮兩種活性物質的含量至23.63 mg/mL、0.24 mg/mL。該復合飲品以蘆筍、藏紅花粉劑的溶液為載體,不僅充分利用了植物乳桿菌的益生功效,并將其與蘆筍的降血脂、降低腫瘤的發生風險的作用有機結合,利用植物乳桿菌發酵一定程度上提高了飲品中總黃酮及多糖的含量,對后期進一步開發發酵藏紅花蘆筍復合飲品提供一定的參考。

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LIU Yi,YAO Lang,HU Jinrong,LI Pinglan*
(Key Laboratory of Functional Dairy,Co-constructed by Ministry of Education and Beijing City,College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Q939.99

0254-5071(2017)11-0165-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.036

2017-06-29

橫向合作項目(29016652)

劉 義(1993-),女,碩士研究生,研究方向為食品微生物。

*通訊作者:李平蘭(1964-),女,教授,博士,研究方向為食品微生物。