利用定點(diǎn)突變及酶切方法制備分子量內(nèi)標(biāo)

張旻南

摘要：分子量內(nèi)標(biāo)是STR分型時(shí)用來標(biāo)定樣品峰大小的重要內(nèi)參，目前常用的內(nèi)標(biāo)如ABI公司LIZ500等都是采用PCR擴(kuò)增的方法制備，這種方法制備的內(nèi)標(biāo)，由于引物二聚體的長度與內(nèi)標(biāo)中的小片段長度相近，不易于純化，因此混有引物峰，容易在數(shù)據(jù)分析時(shí)產(chǎn)生誤判，且不易于規(guī)?；a(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用定點(diǎn)突變技術(shù)結(jié)合酶切PCR產(chǎn)物的方法，制備了從50bp到500bp共14個(gè)片段的分子量內(nèi)標(biāo)，制備的產(chǎn)物沒有引物峰等雜峰，且制備工藝適用于規(guī)模化生產(chǎn)，對(duì)獲得的內(nèi)標(biāo)片段進(jìn)行線性化分析，R值=0.9999，符合線性化要求，可以用作STR分型的分子量內(nèi)標(biāo)。

關(guān)鍵詞：定點(diǎn)突變；酶切；分子量內(nèi)標(biāo)

0 引言

分子量內(nèi)標(biāo)是在進(jìn)行STR檢測時(shí)與樣品在同一通道電泳的一系列長度不同的

DNA片段，在數(shù)據(jù)分析時(shí)，通過分析樣品DNA與分子量內(nèi)標(biāo)的相對(duì)出峰位置，就可以標(biāo)定樣品DNA的大小。在電泳時(shí)，分子量內(nèi)標(biāo)的出峰時(shí)間和峰型也可以反映電泳儀器的工作狀態(tài)。目前常用的分子量內(nèi)標(biāo)，如ABI公司的LIZ500，采用的直接PCR擴(kuò)增的方法制備，得到的產(chǎn)物無法消除引物峰，且由于采用不同引物擴(kuò)增，不同片段的擴(kuò)增效率也有差異，這些問題導(dǎo)致其制備工藝不易于規(guī)?；a(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用定點(diǎn)突變技術(shù)把限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)引入同一DNA片段的不同位置，獲得一系列突變位置不同的重組質(zhì)粒。然后采用同一對(duì)引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒，擴(kuò)增效率相同，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)純化后可以完全去除引物DNA，經(jīng)酶切后的片段峰高易于調(diào)平。本實(shí)驗(yàn)制備的分子量內(nèi)標(biāo)中沒有引物峰等雜峰的影響，峰型良好，線性化分析R值=0.9999，可以作為STR分型的分子量內(nèi)標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

9947DNA，GO taq PCR mix，EcoR V限制性內(nèi)切酶（NEB公司），DpnI限制性內(nèi)切酶，Qiagen DNA純化試劑盒，Qiagen DNA質(zhì)粒提取試劑盒，T載體（TAKARA），DH5α感受態(tài)細(xì)胞，定點(diǎn)突變?cè)噭┖?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

GA118-16A，PCR擴(kuò)增儀（ABI Pro Flex PCR系統(tǒng)），六一平板電泳儀，離心機(jī)（effendorf）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)

從Genebank上查找并下載人類基因組全序列，從中選取一段長度500bp的序列。這段序列要求堿基含量均衡，沒有poly結(jié)構(gòu)、回文結(jié)構(gòu)等特殊序列，使用primer5.0設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：

F： TTCAAGTCAGGGTTTCCAAG

R： TTTTAGAGATAAGGTGTGCGT

其中，引物F的5端采用6FAM熒光標(biāo)記，命名為F-FAM。

1.2.2 目的片段的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的獲得

（1）以9947DNA為模板，F(xiàn)、R為引物，采用GO taq PCR mix進(jìn)行擴(kuò)增。其中，GO taq PCR mix 12.5μl；9947DNA 1μl（濃度1ng/μl）；引物F、R各1μl（濃度10μM）；雙蒸水9.5μl。擴(kuò)增程序：預(yù)變性95℃，5min；95℃，30s；57℃，40s；72℃，30s；40個(gè)循環(huán)；終延伸72℃，10min。

（2）采用Qiagen DNA純化試劑盒對(duì)上步中擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行純化，純化步驟詳見試劑盒說明書。

（3）將純化得到的目的片段連接到T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鋪板并挑斑擴(kuò)大培養(yǎng)（步驟詳見T載體說明書）。

（4）采用Qiagen DNA質(zhì)粒提取試劑盒參照試劑盒說明書提取質(zhì)粒，并測序。測序的序列與Genebank上選取的序列進(jìn)行比對(duì)，要求沒有發(fā)生任何突變，將此質(zhì)粒命名為質(zhì)粒A。

1.2.3 突變質(zhì)粒的獲得

按照定點(diǎn)突變?cè)噭┖姓f明書的操作步驟，在質(zhì)粒A的50bp，75bp，100bp，139bp，150bp，160bp，200bp，250bp，300bp，350bp，400bp，450bp，490bp位點(diǎn)分別進(jìn)行定點(diǎn)突變，引入EcoR V限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)GAT^ATC，得到質(zhì)粒A-50，A-75，A-100，A-139，A-150，A-160，A-200，A-250，A-300，A-350，A-400，A-450，A-490。經(jīng)測序驗(yàn)證，引入的突變位點(diǎn)序列正確。

1.2.4 熒光片段的擴(kuò)增與酶切

（1）以上一步獲得的突變質(zhì)粒為模板，采用GO taq PCR mix進(jìn)行擴(kuò)增，其中GO taq PCR mix 12.5μl；9947DNA 1μl（濃度1ng/μl）；引物F、R各1μl（濃度10μM）；雙蒸水9.5μl。擴(kuò)增程序：預(yù)變性95℃，5min；95℃，30s；57℃，40s；72℃，30s；40個(gè)循環(huán)；終延伸72℃，10min。

（2）采用Qiagen DNA純化試劑盒對(duì)上步中擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行純化，純化步驟詳見試劑盒說明書。

（3）將上步中純化后的產(chǎn)物分別用EcoR V限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切體系：

DNA 1ug，EcoR V酶 1μl，10X buffber 2μl，雙蒸水補(bǔ)足10μl。酶切反應(yīng)條件：30℃孵育30min；65℃滅活20min.。

1.2.5 熒光片段的混合與檢測

將上步酶切得到的片段按一定比例混合，取1μl混合產(chǎn)物與9μl甲酰胺混合，

95℃變性3分鐘，立即置于冰上，在ABI3130上進(jìn)行檢測，進(jìn)樣電壓1kV，進(jìn)樣時(shí)間15s，電泳電壓15kV，電泳時(shí)間1500s。

2 結(jié)果與分析

分子量內(nèi)標(biāo)經(jīng)ABI3130檢測，結(jié)果如圖1所示，峰型完好，沒有引物峰及其他雜峰，各片段峰高均衡。經(jīng)Genenmappper軟件分析，各個(gè)片段大小判定正確。

對(duì)各個(gè)片段的出峰位置和片段大小進(jìn)行線性分析，R值=0.9999，如圖2所示。

本實(shí)驗(yàn)利用定點(diǎn)突變技術(shù)把限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)引入同一DNA片段的不同位置，獲得一系列突變位置不同的重組質(zhì)粒。各重組質(zhì)粒除了酶切位點(diǎn)的位置不同，其他序列完全一致，因此可以采用同一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增效率相同。擴(kuò)增后的片段都是500bp，通過純化可以完全除去引物及引物二聚體。不同重組質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物含有同一個(gè)酶切位點(diǎn)，可以通過一次酶切反應(yīng)得到長度不同的酶切產(chǎn)物。

本實(shí)驗(yàn)制備的分子量內(nèi)標(biāo)中沒有引物峰等雜峰的影響，峰型良好，線性化分析R值=0.9999，可以作為STR分型的分子量內(nèi)標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)方案易于規(guī)?；a(chǎn)，制作的分子量內(nèi)標(biāo)可以完全取代ABI LIZ500作為GA118系列遺傳分析儀的性能檢驗(yàn)試劑。

參考文獻(xiàn)：

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