乳鼠雪旺細胞對自體顱骨組織生長的影響

李鐘鵬，龐芳河

（廣西醫科大學附屬口腔醫院1.綜合門診，2.口腔種植科，廣西 南寧 530021）

基礎研究·論著

乳鼠雪旺細胞對自體顱骨組織生長的影響

李鐘鵬1，龐芳河2

（廣西醫科大學附屬口腔醫院1.綜合門診，2.口腔種植科，廣西 南寧 530021）

目的探討乳鼠雪旺細胞對自體顱骨組織生長的影響。方法體外培養和純化乳鼠雪旺細胞，取乳鼠顱骨組織分為對照組和觀察組。對照組顱骨組織單獨培養，觀察組顱骨組織與雪旺細胞共同培養，培養第1、2和3周時免疫組織化學法測定顱骨組織骨鈣素和骨橋蛋白水平，酶聯免疫法吸附法測定培養液中骨堿性磷酸酶活性含量。結果雪旺細胞在體外被成功培養，純度＞89%。不同時間點骨鈣素水平有差別（P＜0.05）；觀察組和對照組骨鈣素水平有差別（P＜0.05），觀察組骨鈣素水平比對照組高；觀察組和對照組骨鈣素水平變化趨勢有差別（P＜0.05）。不同時間點骨橋蛋白水平無差別（P＞0.05）；觀察組和對照組骨橋蛋白水平無差別（P＞0.05）；觀察組和對照組骨橋蛋白水平變化趨勢無差別（P＞0.05）。不同時間點骨堿性磷酸酶活性有差別（P＜0.05）；觀察組和對照組骨堿性磷酸酶活性有差別（P＜0.05），觀察組骨堿性磷酸酶活性比對照組高；觀察組和對照組骨堿性磷酸酶活性變化趨勢有差別（P＜0.05）。結論雪旺細胞可以提高顱骨組織骨鈣素水平和骨堿性磷酸酶活性，促進顱骨組織的生長。

乳鼠；雪旺細胞；顱骨組織；生長；組織工程。

骨組織工程學發展迅速，保證組織工程化骨組織在體內存活的決定性因素為血液供應和神經支配。當移植骨塊中有神經生長時才能完成新骨的爬行，完整的神經支配在骨折愈合中具有重要作用，神經支配可以調節骨組織的再生[1]。雪旺細胞包繞周圍神經軸突，是周圍神經的主要膠質細胞，是周圍神經組織工程中常用的種子細胞[2-4]。本實驗分離并純化乳鼠雪旺細胞，將其與乳鼠顱骨組織共同培養，觀察其對顱骨組織生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 出生1～5 d、清潔級、雄性SD乳鼠由廣西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK桂2014-0001。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基、胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司，骨鈣素、骨橋蛋白、ASBC免疫組織化學試劑盒，以及兔抗S-100單克隆抗體、胰蛋白酶、分泌性磷酸化蛋白質購自武漢博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 組織取材 取9只乳鼠脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒，解剖顯微鏡下剝離雙側股神經用于乳鼠雪旺細胞的培養；取出顱骨，在培養皿中剪成2 mm×2 mm顱骨碎塊，每只乳鼠取2塊顱骨碎塊，共18塊用于體外培養。

1.2.2 乳鼠雪旺細胞的培養、純化及鑒定 將剝離的雙側股神經置于DMEM高糖培養基，剝離神經外膜，將坐骨神經剪成碎塊，在含坐骨神經組織碎塊的培養基中加入胰蛋白酶消化，過濾消化液，將過濾液置于離心管中，1000 r/min離心5 min，棄上清液加入培養基中重懸細胞，將雪旺細胞密度調整為1×105個/ml，接種到培養皿中培養，12 h后全量換液去除未貼壁細胞，加入阿糖胞苷抑制成纖維細胞，48 h后全量換液，顯微鏡下觀察雪旺細胞生長情況。將培養12 d的雪旺細胞消化并接種到6孔板中培養72 h，采用S-100兔單克隆抗體對雪旺細胞進行鑒定。

1.2.3 分組及處理 將18塊顱骨塊分為對照組和觀察組，每組9塊顱骨塊。對照組顱骨塊在DMEM培養皿中單獨培養。觀察組顱骨塊與雪旺細胞共同培養：將雪旺細胞密度調整為1×106個/ml，取100μl加入DMEM培養皿中，并加入顱骨塊共同培養。兩組顱骨塊均培養3周。

1.2.4 骨鈣素和骨橋蛋白水平測定 分別取對照組和觀察組培養第1、2和3周的顱骨塊進行甲醛固定、石蠟包埋，采用免疫組織化學法測定顱骨組織中骨鈣素和骨橋蛋白水平。將顱骨切片脫臘至水，3%雙氧水H2O2滅活，抗原修復，加入封閉液封閉，加入骨鈣素和骨橋蛋白一抗孵育（1∶100），加入孵育生物素化二抗孵育（1∶150），顯色，加入蘇木素復染，封片觀察。采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統，測量每組9塊顱骨組織中基質和陽性細胞染色光密度值。

1.2.5 培養液中骨堿性磷酸酶表達測定 取對照組和觀察組培養第1、2和3周的培養液，采用酶聯免疫吸附法測定顱骨培養液中骨堿性磷酸酶含量，采用自動酶標儀測定堿性磷酸酶活性。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用重復測量設計的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雪旺細胞形態

大部分雪旺細胞培養24 h后貼壁生長，部分長出細小突起；培養48 h后雪旺細胞形態明顯，胞體呈梭形，兩端突起不等，周邊有亮帶；培養7 d后細胞呈極性生長，胞體平行排列；培養12 d后細胞大部分連接在一起，交織成網狀。見圖1。

2.2 雪旺細胞的鑒定結果及純度

對培養14 d的雪旺細胞采用S-100兔單克隆抗體免疫組織化學法染色，可見雪旺細胞胞體呈梭形，胞漿黃染，邊界清楚。采用細胞計數板進行細胞計數，雪旺細胞的純度＞89%。見圖2。

2.3 兩組骨鈣素水平比較

觀察組和對照組第1、2和3周骨鈣素水平比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點骨鈣素水平有差別（F=21.425，P=0.000）；②觀察組和對照組骨鈣素水平有差別（F=28.416，P=0.000），觀察組骨鈣素水平比對照組高；③觀察組和對照組骨鈣素水平變化趨勢有差別（F=18.325，P=0.000）。見表1和圖3。

2.4 兩組骨橋蛋白水平比較

觀察組和對照組第1、2和3周骨橋蛋白水平比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點骨橋蛋白水平無差別（F=1.324，P=0.253）；②觀察組和對照組骨橋蛋白水平無差別（F=1.032，P=0.426）；③觀察組和對照組骨橋蛋白水平變化趨勢無差別（F=0.856，P=0.583）。見表2和圖4。

2.5 兩組骨堿性磷酸酶活性比較

觀察組和對照組第1、2和3周骨堿性磷酸酶活性比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點骨堿性磷酸酶活性有差別（F=67.536，P=0.000）；②觀察組和對照組骨堿性磷酸酶活性有差別（F=97.537，P=0.000），觀察組骨堿性磷酸酶活性比對照組高；③觀察組和對照組骨堿性磷酸酶活性變化趨勢有差別（F=54.264，P=0.000）。見表3和圖5。

圖1 雪旺細胞 （×400）

圖2 S-100免疫鑒定的雪旺細胞（免疫組織化學法×400）

表1 兩組骨鈣素水平比較（n =9，±s）

表1 兩組骨鈣素水平比較（n =9，±s）

組別 第1周 第2周 第3周對照組 7.51±2.51 8.30±1.76 12.12±1.13觀察組 11.92±3.57 13.67±3.51 18.43±5.21

表2 兩組骨橋蛋白水平比較（n =9，±s）

表2 兩組骨橋蛋白水平比較（n =9，±s）

組別 第1周 第2周 第3周對照組 9.67±1.30 10.07±2.15 9.18±1.06觀察組 10.85±2.00 10.21±1.25 11.02±2.01

圖3 兩組骨鈣素水平變化趨勢

圖4 兩組骨橋蛋白水平變化趨勢

表3 兩組骨堿性磷酸酶活性比較（n =9，金氏單位/L，±s）

表3 兩組骨堿性磷酸酶活性比較（n =9，金氏單位/L，±s）

組別 第1周 第2周 第3周對照組 97.43±12.20 102.59±24.52 137.58±18.16觀察組 123.20±19.63 302.79±60.42 709.71±48.99

圖5 兩組骨堿性磷酸酶活性變化趨勢

3 討論

骨是富含血管、神經、筋膜等組織的復合體，骨的形成和神經系統的發展關系密切，神經細胞對骨吸收及骨形成發揮營養和調節作用[5]。雪旺細胞是神經膠質細胞，是周圍神經的主要功能和結構細胞，參與神經再生過程，雪旺細胞可以分泌數種神經營養因子，促進軸突髓鞘化，提供神經再生需要的營養微環境，協助神經內膜形成，清除細胞碎片，提供神經再生支架[6-7]；雪旺細胞還可分泌多種神經生長因子，對神經細胞的生長發育、再生及存活的維持發揮重要作用，神經生長因子可以防止神經元死亡，促進神經再生，增加軸突數量；雪旺細胞還可分泌白細胞生長因子、轉移生長因子、血小板生長因子等，對增加基質蛋白合成、促進神經傳遞、促進細胞增殖分化發揮重要作用[8]。雪旺細胞是神經再生中唯一可以利用的神經膠質細胞，為常用的周圍神經組織工程的種子細胞[9-10]。

本實驗對乳鼠雪旺細胞進行培養和純化，并將其與乳鼠顱骨細胞共同培養，觀察其對乳鼠顱骨組織生長的影響。結果發現，乳鼠雪旺細胞可被成功培養，純度＞89%，觀察組第1、2和3周的骨鈣素水平和骨堿性磷酸酶活性高于對照組，兩組骨鈣素水平和骨堿性磷酸酶活性隨著時間延長而升高，兩組第1、2和3周的骨橋蛋白水平比較無差異，兩組骨橋蛋白水平隨著時間延長，變化不明顯。骨鈣素是骨轉換和成骨細胞活動的重要指標，骨改建與骨鈣素水平關系密切，成骨細胞功能下降則骨鈣素水平降低，成骨細胞功能增強則骨鈣素水平升高[11-12]，本研究結果發現，乳鼠雪旺細胞可以促進乳鼠顱骨組織中骨鈣素表達，且隨時間延長，顱骨組織中骨鈣素水平升高，表明雪旺細胞可以增強骨組織中成骨細胞功能。骨堿性磷酸酶來源于成骨細胞，是反映骨形成和成骨細胞活性的敏感指標之一，當骨形成大于骨吸收時，血清骨堿性磷酸酶水平升高，當骨組織受外界刺激合成大量成骨細胞時，成骨細胞分泌大量的骨堿性磷酸酶，引起堿性磷酸酶活性增強[13-14]，本研究結果發現，雪旺細胞可以促進培養液中骨堿性磷酸酶活性增強，且隨時間延長，骨堿性磷酸酶活性呈上升趨勢，可見，雪旺細胞具有促進骨組織生長的作用。骨橋蛋白在組織中分布廣泛，是一種分泌型的磷酸化蛋白，骨橋蛋白在骨組織中可由骨細胞、成骨細胞和破骨細胞分泌，骨橋蛋白對破骨細胞和骨基質間的黏附具有識別和調節作用，從而影響骨吸收[15-16]，本研究結果發現，乳鼠雪旺細胞對乳鼠顱骨組織中骨橋蛋白的表達沒有明顯影響，考慮雪旺細胞對骨組織的吸收影響不大。

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（童穎丹 編輯）

Effect of Schwann cells on growth of autogenous skull in neonatal rats

Zhong-peng Li1, Fang-he Pang2
(1. Outpatient Department of Integrated Medicine, 2. Department of Oral Implantology, Dental Hospital Aff i liated to Guangxi Medical University, Nanning, Guangxi 530021, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Schwann cells on the growth characteristics of autogenous skull tissue in neonatal SD rats.MethodsThe neonatal Schwann cells were cultured and puri fi edin vitro. The skull tissues were divided into control group and observation group. The skull tissue of the control group was cultured alone. The skull tissue of the observation group was co-cultured with Schwann cells. In the 1st, 2nd and 3rd weeks of culture, the levels of osteocalcin and osteopontin in the skull tissue were measured by immunohistochemistry, and the bone alkaline phosphatase activity was measured by ELISA.ResultsSchwann cells were successfully culturedin vitrowith the purity over 89%. There were differences in the osteocalcin levels at different time points (P＜ 0.05).There were significant differences in the osteocalcin levels between the observation group and the control group(P＜ 0.05), the levels of osteocalcin in the observation group were higher than those in the control group. There was signi fi cant difference in the change trends of osteocalcin levels between the observation group and the control group (P＜ 0.05). There were no signi fi cant differences in the osteopontin levels at different time points (P＞ 0.05).There were no signi fi cant differences in the osteopontin levels between the observation group and the control group(P＞ 0.05). There was no signi fi cant difference in the change trends of osteopontin levels between the observation group and the control group (P＞ 0.05). The activity of bone alkaline phosphatase was different at different time points (P＜ 0.05). There was signi fi cant difference in the bone alkaline phosphatase activity between the observation group and the control group (P＜ 0.05), the activity of bone alkaline phosphatase in the observation group was higher than that in the control group. There was signi fi cant difference in the change trends of bone alkaline phosphatase activity between the observation group and the control group (P＜ 0.05).ConclusionsSchwann cells can increase osteocalcin level and bone alkaline phosphatase activity of skull tissue, and promote the growth of skull tissue.

neonatal rat; Schwann cell; skull tissue; growth; tissue engineering

R329

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.29.001

1005-8982（2017）29-0001-05

2016-06-19

龐芳河，E-mail：1271875788@qq.com；Tel：18578920688