Bcl-2基因沉默對胃腺癌SGC-7901細胞5-Fu敏感性的影響*

丁哲宇，杜鋒，王繼紅，甘晟，寸英麗

（云南省腫瘤醫院 腹部外科，云南 昆明 650000）

Bcl-2基因沉默對胃腺癌SGC-7901細胞5-Fu敏感性的影響*

丁哲宇，杜鋒，王繼紅，甘晟，寸英麗

（云南省腫瘤醫院 腹部外科，云南 昆明 650000）

目的探討B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）基因沉默增強胃腺癌SGC-7901細胞對5-氟尿嘧啶（5-FU）敏感性的價值。方法設立人胃腺癌SGC-7901細胞研究組和對照組，采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）檢測兩組人胃腺癌SGC-7901細胞中Bcl-2 mRNA的表達。研究組采用脂質體法轉染化學合成的Bcl-2 siRNA序列至人胃腺癌SGC-7901細胞，對照組不進行干預。比較轉染前后兩組Bcl-2 mRNA的表達水平。兩組均添加不同濃度5-FU，采用Annexin V標記和流式細胞儀檢測48 h后兩組不同濃度5-FU細胞株的增殖抑制率和凋亡率。結果兩組轉染前Bcl-2 mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與轉染前比較，研究組轉染后的Bcl-2 mRNA相對表達量降低（P＜0.05）；與對照組比較，研究組轉染后的Bcl-2 mRNA相對表達量降低（P＜0.05）。與對照組比較，研究組培養48 h的細胞增殖抑制率和凋亡率較高（P＜0.05）。結論Bcl-2基因沉默可增強胃腺癌SGC-7901細胞對5-FU的敏感性，抑制癌細胞的增殖，并促進癌細胞的凋亡。Bcl-2基因沉默可能是改善胃腺癌5-FU療效的有效方法。

B淋巴細胞瘤-2；基因沉默；增強；胃腺癌；SGC-7901 細胞；5-氟尿嘧啶；敏感性

胃癌發病率和病死率較高，預后差，5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是其常用藥物[1-3]。然而化療藥物作用有限，常出現化療耐藥[4]。從基因水平上逆轉化療抵抗性可取得良好的效果[5]。而B淋巴細胞瘤-2（B lymphocyte tumor-2，Bcl-2）基因亦是與胃癌密切相關的因子[6]。因此，本研究分析Bcl-2基因沉默對胃腺癌SGC-7901細胞的增殖抑制情況和細胞凋亡的影響，旨在為Bcl-2基因沉默改善胃癌5-FU化療敏感性提供依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃腺癌SGC-7901細胞由上海細胞研究所提供。恒溫箱（江蘇佳美儀器有限公司），流式細胞儀（德國Partec公司），離心管、玻璃瓶、吸管、試管等購自廣東東普醫療科技有限公司，RPMI 1640培養基和胎牛血清（武漢博士德生物工程有限公司），RNA提取試劑盒（德國Qiagen公司），cDNA合成試劑盒（美國Promega公司），實時定量PCR試劑盒和SYBR Premix EX Taq（日本TaKaRa公司），5-Fu（浙江海正藥業公司），MTT（美國Amersco公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（美國Amersco公司），脂質體轉染液 LipofectamineTM（美國Invitrogen 公司），細胞培養箱、細胞培養板購自美國SHELLAB公司，華東電子酶標儀DG5033A（南京華東電子管廠），Bcl-2多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 設立人胃腺癌SGC-7901細胞研究組和對照組，每組3個培養皿，分別標記研究組50μg/ml、研究組 100μg/ml、研究組 200μg/ml、對照組 50μg/ml、對照組100μg/ml及對照組200μg/ml。

1.2.2 細胞培養 培養皿含10%新鮮胎牛血清和RPMI 1640培養液，在37℃、5%二氧化碳C02飽和濕度環境的細胞培養箱中培養24 h。

1.2.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） RT-PCR檢測兩組人胃腺癌SGC-7901細胞中Bcl-2 mRNA的表達，收集細胞，棄上清液后提取總RNA，通過cDNA試劑盒逆轉錄合成cDNA，其中Bcl-2 siRNA正向引物：5'-GUACAUCCAUUAUAAGCUGdTdT-3'，反向引物：5'-TdTdCAUGUAGGUAAUAUUCGAC-3'。以該cDNA為模版擴增Bcl-2，采用兩步法，95℃預變性15 s，95℃變性 15 s，60℃退火 30 s，共 45 個循環，采用 2-ΔΔCt法計算Bcl-2 mRNA相對表達量。

1.2.4 合成序列 選用廣州RIBIBIO公司化學合成的Bcl-2 siRNA序列，Bcl-2 siRNA靶序列為5'-GTACATCCATTATAAGCTG-3'。

1.2.5Bcl-2基因轉染 研究組細胞抽出原細胞液，添加RPMI 1640培養液80μl和脂質體轉染液LipofectamineTM24μl，加入 30μl化學合成的 Bcl-2 siRNA，輕輕混勻。采用脂質體法轉染化學合成的Bcl-2 siRNA序列至研究組人胃腺癌SGC-7901細胞，培養48 h。對照組不進行干預，以RPMI 1640培養液80μl和脂質體轉染液 LipofectamineTM24μl同期進行培養48 h。

1.2.6 Bcl -2 mRNA的表達 再次行RT-PCR檢測，比較轉染前后兩組Bcl-2 mRNA的表達，方法同1.2.3。

1.2.7 細胞增長抑制率的檢測 取對數生長期細胞，以5×105個細胞接種于96孔細胞培養板中，根據取樣培養皿標記相應培養板，在兩組對應標記的培養板中添加50、100和200μg/ml 5-FU，兩組另設空白對照組，培養48 h后加入1 mg/ml MTT 1 ml。繼續培養4 h后，加入0.1 ml DMSO溶液，37℃孵育30 min，在華東電子酶標儀DG5033A上自動讀數，獲取波長570 nm處的光密度（optical density，OD）值，以空白對照組為標準，計算各組細胞增長抑制率。細胞增長抑制率=（5-FU孔OD值-空白孔OD值）/空白孔OD值。

1.2.8 細胞凋亡率的檢測 取對數生長期細胞，以5×105個細胞接種于96孔細胞培養板中，根據取樣培養皿標記相應培養板，在兩組對應標記的培養板中分別添加50、100和200μg/ml 5-FU。培養48 h后用0.25%胰蛋白酶處理2 min，800 r/min離心5 min，收集細胞，PBS液洗滌2次，加入10 mg/ml RNAse溶液150μl，培養30 min后碘化丙啶50 ml染色，300目尼龍網過濾后行Annexin V標記，采用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡情況。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗或析因設計的方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組轉染前后Bcl-2 mRNA相對表達量比較

研究組轉染前Bcl-2 mRNA相對表達量為與對照組比較，經兩獨立樣本t檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）。研究組轉染后Bcl-2 mRNA相對表達量與對照組比較，經兩獨立樣本t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），研究組低于對照組。見表1。

表1 兩組轉染前后Bcl-2 mRNA相對表達量比較 （±s）

表1 兩組轉染前后Bcl-2 mRNA相對表達量比較 （±s）

組別 轉染前 轉染后研究組 0.872±0.106 0.113±0.103對照組 0.887±0.105 0.886±0.108 t值 0.985 50.749 P值 0.828 0.000

2.2 兩組細胞增殖抑制率及凋亡率比較

研究組48 h不同濃度5-FU細胞的增殖抑制率和凋亡率比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=11.927和6.433，P=0.000和0.016）。對照組48 h不同濃度5-FU細胞的增殖抑制率和凋亡率比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=12.866和8.029，均P=0.000）。 兩 組 50、100和 200μg/ml 5-FU 均可取得較好的胃腺癌SGC-7901細胞抑制效果，50和100μg/ml 5-FU的抑制效果差異較大，而100和200μg/ml 5-FU的抑制效果差異不明顯，達100μg/ml后增加5-FU濃度對其細胞抑制效果影響不大。見表2和圖1～3。

表2 兩組細胞增殖抑制率及凋亡率比較 （%，x±s）

圖1 兩組細胞增殖抑制率比較

圖2 兩組細胞凋亡率比較

圖3 兩組不同濃度5-Fu細胞凋亡情況

3 討論

近年來隨著生活方式的改變，各類消化系統惡性腫瘤的發生不斷增加。胃癌是臨床常見消化系統惡性腫瘤，其發病率高。然而由于早期癥狀不明顯，無特異性癥狀，早期診斷困難，多數患者出現癥狀確診時已為晚期，錯過手術治療的最佳時機，常需選取其他姑息治療方法[7-8]。化療是胃癌手術外的首選治療方法，而5-FU是其常用化療藥物，其在胃癌治療中的效果已得到多個臨床研究的認可[9-10]。然而胃癌化療的特異性差，不良反應較多，且容易發生化療藥物的耐藥[11]。從開發新藥的角度改善胃癌化療效果，已無法滿足臨床需求。尋找新的途徑改善胃癌5-FU化療效果，是目前臨床急需解決的難題。

近年來關于癌癥的研究中，基因學占據重要地位。有臨床研究致力于通過基因沉默等措施，增強癌癥化療藥物的敏感性，并取得一定的效果[12]。廉超等[13]研究發現，E2F轉錄因子沉默有助于提高人胃腺癌SGC-7901細胞對順鉑的敏感性，可能作為胃癌藥物治療的靶點之一。BOYER等[14]研究發現， siRNA轉染影響胰腺癌和肺癌的化療耐藥相關基因，有助于改善其化療效果。Bcl-2基因是細胞凋亡控制的關鍵基因，可保護細胞免受凋亡的基因，亦是與胃癌密切相關的基因[15]。倪志超等[16]采用RNA干擾沉默Bcl-2基因，觀察其對人黑素瘤細胞生長抑制的效果，研究結果顯示，Bcl-2 mRNA可顯著降低人黑素瘤M14細胞株Bcl-2蛋白表達，有效抑制癌細胞的生長。因此，Bcl-2基因靶向沉默亦可能對其5-FU化療敏感性有影響。然而，目前關于Bcl-2基因沉默增強胃腺癌SGC-7901細胞對5-FU敏感性的研究較少。

本研究采用化學合成的Bcl-2 siRNA序列，轉染至胃腺癌SGC-7901 細胞。結果發現，Bcl-2 siRNA序列轉染至胃腺癌SGC-7901細胞后，Bcl-2 mRNA相對表達量降低，Bcl-2 siRNA序列轉染至胃腺癌SGC-7901細胞可達Bcl-2基因沉默效果。分別對Bcl-2基因沉默和未對Bcl-2基因進行沉默處理的胃腺癌SGC-7901細胞加入50、100和200μg/ml 5-FU，培養48 h后檢測其細胞增殖抑制和細胞凋亡情況。本研究結果顯示，50、100和200μg/ml 5-FU均可取得較好的胃腺癌SGC-7901細胞抑制效果，50和100μg/ml 5-FU的抑制效果差異較大；在一定濃度范圍內增大5-FU用量有助于改善療效，而100和200μg/ml 5-FU的抑制效果差異不明顯，達100μg/ml后增加5-FU濃度對其細胞抑制效果影響不大；且經Bcl-2基因進行沉默處理的胃腺癌SGC-7901細胞的增殖抑制率及凋亡率更高，經Bcl-2基因沉默可能成為改善胃癌5-FU化療效果的措施之一，且Bcl-2基因可能作為胃癌基因治療的靶基因之一。

綜上所述，Bcl-2 siRNA序列可有效沉默Bcl-2，而Bcl-2基因沉默可抑制癌細胞的增殖，并促進癌細胞的凋亡，增強胃腺癌SGC-7901細胞對5-FU的敏感性。Bcl-2基因沉默可能是改善胃腺癌5-FU療效的有效方法。

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（童穎丹 編輯）

Impact of BCL2 gene silencing on 5-Fu sensitivity in gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells*

Zhe-yu Ding, Feng Du, Ji-hong Wang, Sheng Gan, Ying-li Cun
(Department of Abdominal Surgery, Yunnan Cancer Hospital, Kunming, Yunnan 650000, China)

ObjectiveTo explore the value of B cell lymphoma 2 (BCL2) gene silencing in enhancing 5-fluorouracil (5-FU) sensitivity in gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells.MethodsHuman gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells were set up as research group and control group. In the research group, chemicallysynthesizedBCL2siRNA sequence was transfected into gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells by liposome method;while the control group had no relative intervention. RT-PCR was applied in detection ofBCL2mRNA expression in gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells of the two groups before and after transfection. Both groups were added with different concentrations of 5-FU and tagged with Annexin V; 48 h after adding 5-FU fl ow cytometry was applied to detect cell proliferation inhibition rate and apoptosis rate.ResultsBefore transfection the relative expression ofBCL2mRNA had no statistical difference between the two groups (P＞ 0.05). The relative expression ofBCL2mRNA in the research group decreased after transfection compared to that before transfection and that in the control group(P＜ 0.05). After cell culture for 48 h, the proliferation inhibition and apoptosis rates of the research group were higher than those of the control group (P＜ 0.05).ConclusionsBCL2gene silencing can enhance 5-FU sensitivity in gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells, inhibit cancer cell proliferation and promote cancer cell apoptosis; therefore,BCL2gene silencing may be an effective way to enhance the effect of 5-FU therapy for gastric adenocarcinoma.

B cell lymphoma 2; gene silencing; enhance; gastric adenocarcinoma; SGC-7901 cell;5- fluorouracil; sensitivity

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.29.003

1005-8982（2017）29-0011-05

2016-10-15

昆醫聯合專項（No：2010CD179）

寸英麗，E-mail：cunying@medmail.com.cn