萬古霉素單用及聯合用藥對MRSA耐藥性的影響

翟蕙，李家斌

（安徽醫科大學第一附屬醫院 感染科，安徽 合肥 230022）

萬古霉素單用及聯合用藥對MRSA耐藥性的影響

翟蕙，李家斌

（安徽醫科大學第一附屬醫院 感染科，安徽 合肥 230022）

目的培養耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的臨床分離菌株，比較萬古霉素單用與聯合其他抗生素對MRSA的影響。方法采用瓊脂平板倍比稀釋法配置肉湯培養基，培養1×1010CFU/ml濃度的細菌，測定上述抗菌藥物單用及聯合使用對10株MRSA臨床分離株的防耐藥突變濃度（MPC），并計算相應的選擇指數（SI）和耐藥頻率。結果萬古霉素單獨用藥組中，對MRSA的SI為16～64；萬古霉素與利福平聯合應用時，SI為2～6；萬古霉素與磷霉素聯合應用時，SI為1～8；并且耐藥頻率也呈下降趨勢。結論萬古霉素分別與利福平、磷霉素聯合使用，可降低其單用的MPC，縮小耐藥突變選擇窗，防止耐藥突變菌的產生。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；萬古霉素；聯合用藥；防耐藥突變濃度；耐藥突變選擇窗；耐藥頻率

萬古霉素的抗菌譜主要針對革蘭陽性菌，其中最有效的是抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的感染。由于耐藥菌菌屬范圍不斷擴大，對耐藥菌的抑制顯得尤為重要，這也凸顯出萬古霉素在治療MRSA感染中的重要性[1-2]。按照耐藥突變選擇窗（mutant selection windows，MSW）理論確定細菌耐藥性的產生和標準，監測其血藥谷濃度，評價血藥谷濃度與臨床療效的關系，為臨床制定個體化方案，實現合理化用藥具有重要意義[3-4]。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與鑒定

耐藥菌種主要為安徽省細菌耐藥監測中心2014～2015年上報的耐藥菌種類。根據菌種的藥敏性質將MRSA挑選出來，并且保證挑出的菌種對磷霉素的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≤16.0μg/ml，共10個菌株。依據參考文獻[5]確定MRSA的菌屬特征。

1.2 培養基與儀器

MH培養基（英國Oxiod公司），恒溫振蕩培養箱（江蘇國勝儀器廠），細菌比濁儀（英國Oxiod公司），32 R低溫離心機（德國Hettich公司），多點接種儀（英國 AQS Manufacturing 公司）。

1.3 抗菌藥物及試劑

萬古霉素標準品（純度100%）、磷霉素標準品（低聚果糖低聚果糖純度99%）購自北京中國藥品生物制品檢定所。利福平（RET脂蛋白純度97%）、6-磷酸葡萄糖（500 mg/瓶，純度98%～100%）購自美國Sigma公司。

1.4 MIC測定

測定方式為瓊脂平板倍比稀釋法，依據美國臨床實驗室標準化委員會2010年標準中規定的詳細指標進行分析[6]。針對磷霉素的MIC測定也要按照瓊脂稀釋法操作，根據美國臨床實驗室標準化委員會對MIC的測定規定[6]，需要將6-磷酸葡萄糖以25μg/ml的濃度加入瓊脂平板中。

1.5 防耐藥突變濃度的測定

1.5.1 含單藥瓊脂平板的配制 研究對象的防耐藥突變濃度（mutation preventive concentration，MPC）測定根據參考文獻[7]。將瓊脂平板分為7個不同濃度，對應每種藥物單獨的MIC。藥物終濃度分別為各菌株的1×MIC、2×MIC……64×MIC。每個濃度配制4個平板。配置好濃度為25μg/ml的6-磷酸葡萄糖，分別滴入各組的瓊脂板，測出磷霉素的MPC值。

1.5.2 含2種藥物瓊脂平板的配制 將萬古霉素配制為幾組不同濃度值的1 ml液體，同時配制1 ml RET脂蛋白，濃度設置為4.0μg/ml，MH瓊脂18 ml，將幾種材料置于90 mm培養皿中混合。將不同濃度的含有2種抗生素聯合抑菌的瓊脂平板進行標記，平均每個濃度的瓊脂平板保留4個樣本。

1.5.3 MPC、選擇指數及耐藥頻率的測定 將培養好的菌落接種于新的MH培養基（20 ml）中，37℃恒溫培養箱中震蕩培養12 h。3 000 r/min離心后去上清，將沉淀物混入新的培養基中，繼續震蕩培養菌落6 h后再次離心操作，用比濁儀檢測整體溶液的濃度，將其控制在3×1010CFU/ml。將之前制作的不同濃度的瓊脂平板標記好，吸出最終確定濃度的菌落液體100 ml，將其均勻涂抹在瓊脂平板上，不同濃度的瓊脂板各保留4個樣本，每個樣本涂抹1.2×1010CFU的菌液。35℃培養72 h，以無細菌生長的最低藥物濃度為MPC。保留耐藥菌的突變基因。選擇指數（selection index，SI）=MPC/MIC。耐藥頻率=瓊脂平板上測定的菌落數值/實驗接種的菌落數值。以上實驗重復3次，取其平均值。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抗菌藥物的MIC比較

萬古霉素、利福平及磷霉素的MIC分別為（0.950±0.497）、（0.009±0.004） 和（9.300±6.325）μg/ml，經方差分析，差異有統計學意義（F=19.491，P=0.000）。見表 1。

2.2 抗菌藥物單用及聯合使用對MPC和SI的影響

萬古霉素與利福平、磷霉素聯合使用的MPC分別為（7.800±3.584）和（3.600±2.011）μg/ml，萬古霉素單用時MPC為（30.400±14.095）μg/ml。經方差分析，差異有統計學意義（F=29.242，P=0.000）。

萬古霉素與利福平、磷霉素聯合使用的SI分別為（8.600±4.427）和（3.800±1.932），萬古霉素單用時SI為（32.000±13.064）。其SI比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=35.202，P=0.000）。萬古霉素聯合利福平和萬古霉素聯合磷霉素的SI優于萬古霉素單用（P＜0.05）。見表 2。

2.3 萬古霉素對MRSA耐藥頻率的影響

萬古霉素單用 1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC及 32×MIC對 10株 MRSA的 耐藥頻率分別為1.50×10-5～ 2.54×10-6、2.42×10-6～1.86×10-7、7.85×10-6～ 5.66×10-7、3.28×10-7～1.61×10-8、1.70×10-8～ 3.34×10-9和 2.34×10-9。

2.4 萬古霉素與利福平聯合使用對MRSA耐藥頻率的影響

萬古霉素單用及與利福平聯合使用對MRSA的耐藥頻率分別為：1×MIC（8.77×10-6±7.28×10-6）和（2.68×10-8±2.07×10-8）；2×MIC（1.23×10-6±1.02×10-6）和（2.01×10-8±1.21×10-8）；4×MIC（4.20×10-7±3.34×10-7） 和（6.26×10-9±6.44×10-9）經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.826、4.574和4.356，P=0.003、0.002和0.001），萬古霉素與利福平聯用時耐藥頻率優于萬古霉素單用。見表3。

2.5 萬古霉素與磷霉素聯合使用對MRSA耐藥頻率的影響

萬古霉素與磷霉素、萬古霉素與利福平聯合使用對MRSA的耐藥頻率分別為：1×MIC（1.42×10-7±1.24×10-7）和（2.68×10-8±2.07×10-8）；2×MIC（8.59×10-8±1.03×10-7）和（2.01×10-8±1.21×10-8）；4×MIC（1.47×10-7±1.43×10-7）和（6.26×10-9± 6.44×10-9），其與萬古霉素單用3種耐藥頻率比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=16.582，P=0.000）。萬古霉素與磷霉素、利福平聯合使用的耐藥頻率與其單用比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.901，P=0.004），萬古霉素與磷霉素、利福平聯合使用的耐藥頻率優于萬古霉素單用。見表4。

表1 3種抗菌藥物的MIC比較 （μg/ml）

表2 萬古霉素單用及聯合使用對MPC和SI的影響

表3 萬古霉素與利福平聯合使用對MRSA耐藥頻率的影響

表4 萬古霉素與磷霉素聯合使用對MRSA耐藥頻率的影響

3 討論

隨著抗生素的普及，人類治療疾病有了革命性的進步。但是由于人類對醫療認知的不足，導致抗生素在過去一個世紀被大量濫用，最終導致大量耐藥菌的產生。其中包括MRSA，其在院內感染的細菌菌種中最高發，患者死亡率居高不下。對于MRSA的治療一直采用萬古霉素單一的抗生素，但是臨床研究提出萬古霉素的治愈率＜60%[8]。這在一定程度上證明，MRSA已經出現基因突變，對萬古霉素產生耐藥菌株。MSW理論認為，細菌的MPC值較抗生素濃度低時，需要病原菌進行自身的基因突變，并且要達到2次傳代繁殖時，耐藥基因才能穩定，連續2次傳代的基因突變在概率上微乎其微。由此可見，在判斷細菌對抗生素的耐藥性時，可以將MPC值作為一個重要指標。胡暉等[9]在相關臨床藥物研究報告中提出，其實驗中檢測122株MRSA的臨床分離菌株在經過萬古霉素干擾時的MPC值的變化，得出結果為MPC 90值達22.4μg/ml。本實驗中，最終得到的數據為16～64μg/ml，與胡暉等[9]一致。萬古霉素很難進入組織器官的代謝屏障，難以達到預期效果，因此臨床上一般將萬古霉素與其他抗生素聯合應用，以控制細菌感染[10-12]。

李朝霞等[13]對萬古霉素與左氧氟沙星在臨床抗感染治療中的療效進行比較，結果表明，聯合用藥的觀察組對金黃色葡萄球菌ATCC29213的MSW影響減少4～8倍。ZHANEL等[14]也比較了萬古霉素與其他多種抗生素聯合用藥的效果，結果顯示，萬古霉素與其他抗生素聯合應用時，測試菌株的SI呈明顯的下降趨勢。而研究顯示，萬古霉素等抗生素依然對MRSA具有較高的藥物敏感性[15-16]。

雖然利福平對10株MRSA的MIC≤0.016μg/ml，MPC卻高到無法測出（＞1 024μg/ml），而磷霉素的MPC則為128～1 024μg/ml，其MSW較利福平窄的多。由此可見，單獨用藥的MSW與聯合用藥的MPC下降幅度呈負相關，與喻婷[17]、梅清等[18]的研究結果一致。

當萬古霉素與利福平、磷霉素聯合應用時，細菌的耐藥突變頻率呈現下降趨勢。聯合用藥進行抗感染治療后，細菌菌株中依然有耐藥基因表達的出現，但是耐藥基因突變的數量急劇減少，不足以引起大規模耐藥菌的繁殖。

大量的臨床抗感染治療都需要聯合使用抗生素。萬古霉素在控制細菌感染中也有與其他抗生素聯合使用的情況，該治療方案得到了藥理學的理論支持[19-21]。本實驗結果表明，萬古霉素與利福平、磷霉素聯合使用能夠降低耐藥菌的耐藥基因突變概率，使耐藥基因在菌株細胞中難以表達，達到控制MRSA大規模增殖感染的目的。因為藥物進入人體血漿代謝過程中，隨著機體代謝速率的變化，其血漿清除率和藥物代謝率都處于變化的狀態，所以本研究結果還需臨床驗證。

[1]PAULSEN I T, BANERJEI L, MYERS G S A, et al. Role of mobile dna in the evolution of vancomycin-resistant[J]. Science, 2015,6(10): 11-14.

[2]雍小蘭, 胡婷婷, 董朝暉. 從1例臨床實例分析萬古霉素MIC值高漂MRSA感染的治療[J]. 中國新藥雜志, 2010, 6(8): 688-690.

[3]HASAN M A, KHAN M A, SHARMIN T, et al. Identification of putative drug targets in vancomycin-resistant staphylococcus aureus (VRSA) using computer aided protein data analysis[J].Gene, 2015, 575(1): 132-143.

[4]SINEL C, JAUSSAUD C, AUZOU M, et al. Mutant prevention concentrations of daptomycin for enterococcus faecium clinical isolates[J]. International Journal of Antimicrobial Agents, 2016,48(4): 449-452.

[5]Clinical and Laboratory Standards Institute /NCCLS． Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twentieth informational supplement[S]． CLSI Document，2010， 30( 1) : 1-153．

[6]陽志強, 郭兆彪, 宋亞軍, 等. 用雙重聚合酶鏈快速鑒別葡萄球菌及其甲氧西林耐藥性[J]. 中華醫院感染學雜志, 2003, 13(10):916-918.

[7]SILVA L V, ARAúJO M T, SANTOS K R, et al. Evaluation of the synergistic potential of vancomycin combined with other antimicrobial agents against methicillin-resistant staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococcus spp strains[J].Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz, 2011, 106(1): 44.

[8]尹秋生, 冬蘭, 畢磊. 抗菌藥物治療多重耐藥革蘭陽性球菌的進展[J]. 中華保健醫學雜志, 2014, 4(3): 23-26.

[9]胡暉, 唐清. 萬古霉素和利奈唑胺對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌防耐藥變異濃度的測定[J]. 實用預防醫學, 2010, 2: 374-375.

[10]SHENOY E S, LEE H, HOU T, et al. The impact of methicillinresistant staphylococcus aureus (mrsa) and vancomycin-resistant enterococcus (VRE) flags on hospital operations[J]. Infection Control Hospital Epidemiology, 2016, 37(7): 1-9.

[11]ASHWIN K S, MURALIDHARAN N P. Vancomycin-resistant enterococcus (VRE) vs methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA)[J]. Indian Journal of Medical Microbiology,2015, 33 (5): 166-167.

[12]HASAN R, ACHARJEE M, NOOR R. Prevalence of vancomycin resistant staphylococcus aureus (VRSA) in methicillin resistant s.aureus (MRSA) strains isolated from burn wound infections[J].Tzu Chi Medical Journal, 2016, 2(6): 63-64.

[13]李朝霞, 劉又寧, 王睿, 等. 左氧氟沙星聯合萬古霉素縮小金黃色葡萄球菌耐藥突變選擇窗的初步研究[J]. 中國臨床藥理學與治療學, 2007, 8: 911-914.

[14]ZHANEL G G, MAYER M N, ADAM H J. Mutant prevention concentrations of levofloxacin alone and in combination with azithromycin, ceftazidime, colistin (polymyxin E), meropenem,piperacillin-tazobactam, and tobramycin against pseudomonas aeruginosa[J]. Antimicrobial Agents Chemotherapy, 2006, 50(6):2228-2230.

[15]ISLAM T A B, SHAMSUZZAMAN S M. Prevalence and antimicrobial susceptibility pattern of methicillin-resistant,vancomycin-resistant, and panton-valentine leukocidin positive staphylococcus aureus in a tertiary care hospital dhaka,bangladesh[J]. Tzu Chi Medical Journal, 2015, 27(1): 10-14.

[16]MORRILL H. Vancomycin dosing in obese and morbidly obese patients with methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA)pneumonia[J]. Urologia Internationalis, 2014, 93(1): 402-406.

[17]喻婷, 梅清, 朱玉林,等. 萬古霉素聯合用藥降低對金黃色葡萄球菌防耐藥突變濃度的研究[J]. 中國抗生素雜志, 2011, 11:859-863.

[18]梅清, 喻婷, 朱玉林, 等. 萬古霉素單用及聯合利福平或磷霉素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌防耐藥突變濃度的研究[J].中國藥理學通報, 2011, 27(7): 944-947.

[19]MARTíNKOVá J. Current view of vancomycin in the treatment of methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA)infections[J]. Klinicka Mikrobiologie a Infekcni Lekarstvi, 2015,21(1): 16-23.

[20]FORD C D, LOPANSRI B K, GAZDIK M A, et al. The clinical impact of vancomycin-resistant enterococcus colonization and bloodstream infection in patients undergoing autologous transplantation[J]. Transplant Infectious Disease, 2015, 14(14):5329-5332.

[21]KIM Y J, KIM S I, CHOI J Y, et al. Clinical significance of methicillin-resistant staphylococcus aureus and vancomycin-resistant enterococci colonization in liver transplant recipients[J].Korean Journal of Internal Medicine, 2015, 30(5): 694-704.

（童穎丹 編輯）

Effect of single use and combined use of Vancomycin on drug resistance of MRSA

Hui Zhai, Jia-bin Li
(Department of Infectious Diseases, the First Aff i liated Hospital of Anhui Medical University,Hefei, Anhui 230022, China)

ObjectiveTo culture the clinical isolates of Methicillin-resistantStaphylococcus aureus(MRSA)and compare the efficacy of single and combined use of Vancomycin against MRSA infection.MethodsAgar dilution method was applied to confect broth culture medium, which was used to culture 1×1010CFU/ml concentration of bacteria. The mutant prevention concentrations of single and combined use of Vancomycin for 10 clinical isolates of MRSA were determined, and then the corresponding selection index and the frequency of drug resistance were calculated.ResultsFor the 10 MRSA isolates, the selection indexes of Vancomycin used alone were 16-64, the selection indexes of Vancomycin combined with Rifampicin were 2-6, and the selection indexes of Vancomycin combined with Fosfomycin were 1-8; meanwhile the frequency of drug resistance showed a downward trend.ConclusionsCompared to single use, Vancomycin combined with Rifampin or Fosfomycin can reduce the mutant prevention concentration for MRSA, and narrow the drug-resistant mutant selection window, and prevent the production of drug-resistant mutant bacteria.

Methicillin-resistantStaphylococcus aureus; Vancomycin; drug combination; mutant prevention concentration; drug-resistant mutant selection window; frequency of drug resistance

R446.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.29.004

1005-8982（2017）29-0016-05

2016-09-23

李家斌，E-mail：lijiabin948@vip.sohu.com