潰瘍性結腸炎患者外周血中IL-32表達水平及其意義

陳亮 ，汪啟斌 ，董榮坤 ，黃建朋 ，汪彪 ，張健 ，王佩，甘云輝，張征，梁俊

（1.湖北醫藥學院附屬人民醫院 胃腸外科，湖北 十堰 442200；2.中山大學附屬第七醫院 胃腸外科，廣東 深圳 518107）

潰瘍性結腸炎患者外周血中IL-32表達水平及其意義

陳亮1，汪啟斌1，董榮坤1，黃建朋2，汪彪1，張健1，王佩1，甘云輝1，張征1，梁俊1

（1.湖北醫藥學院附屬人民醫院 胃腸外科，湖北 十堰 442200；2.中山大學附屬第七醫院 胃腸外科，廣東 深圳 518107）

目的檢測潰瘍性結腸炎（UC）患者外周血中白細胞介素32（IL-32）表達水平，分析IL-32表達水平與UC嚴重程度的關系。方法入組50例UC患者（UC組，根據病情分為輕、中、重度）及30例健康體檢者（對照組），分別收集UC組和對照組患者的外周血，用Trizol提取外周血中淋巴細胞總RNA，實時聚合酶鏈反應檢測IL-32 mRNA表達水平；用酶聯免疫吸附法檢測外周血中IL-32蛋白表達水平，比較兩組外周血中IL-32表達水平，以及輕、中、重度UC患者IL-32表達水平。結果UC患者外周血中IL-32 mRNA和蛋白表達水平與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；重度UC患者外周血中IL-32表達水平與輕、中度比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論UC患者外周血中IL-32表達增高，IL-32可能參與UC的發病。

潰瘍性結腸炎；白細胞介素32；外周血

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是慢性、非特異性、腸道炎癥性疾病，病變主要累及乙狀結腸和直腸，亦可累及全部結腸，腸道炎癥常反復發生，易引起中毒性結腸擴張、癌變等并發癥，其發病機制尚未完全明確[1]。目前研究認為，腸壁黏膜免疫調節異常、持續腸道感染及細胞因子等與UC的發病密切相關。白細胞介素32（Interleukin-32，IL-32）是一種促炎癥細胞因子，可以活化核轉錄因子-kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）、分裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK） 信 號通路誘導腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素8（Interleukin-8，IL-8）等細胞因子表達，與風濕性關節炎等炎癥性疾病的發病密切相關[2-4]。因此，本研究收集UC患者外周血標本，檢測IL-32表達水平，分析其與UC患者病情嚴重程度的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年9月-2014年9月在湖北醫藥學院附屬人民醫院消化內科、胃腸外科診斷為UC的患者50例。其中，男性20例，女性30例；年齡20～65歲，平均（40.8±8.6）歲。UC的診斷標準參照《2010年世界胃腸病學組織關于炎癥性腸病診斷和治療的實踐指南》[5]制定的診斷標準。UC患者根據病情進行分級：輕度16例，中度20例，重度14。對照組30例為本院體檢中心體檢的健康居民。其中，男性14例，女性16例；年齡19～62歲，平均（40.2±7.8）歲。兩組患者在性別、年齡上比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 標本收集

UC組和對照組于晨起采空腹肘靜脈血10 ml，取4 ml放入非抗凝干燥無菌真空管中，室溫靜置1 h自行凝固，1 300 r/min離心15 min，取上清液分裝于離心管內，置于-80℃冰箱低溫冷凍保存。取6 ml放入含肝素的無菌抗凝管，Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞。

1.3 RNA提取及實時聚合酶鏈反應

用Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）提取細胞總RNA，具體步驟按說明書操作。用逆轉錄試劑盒（日本Toyobo公司）將提取的細胞總RNA逆轉錄為cDNA，按說明書操作。然后用實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）Faststart Universal SYBR Green Master（Rox）試劑盒（瑞士Roche公司）擴增，按說明書操作。擴增IL-32正向引物：5’-CGACTTCAAAGAGGGCTACC-3’，反向引物：5’-GAGTGAGCTCTGGGTGCTG-3’[6]。用β-actin作為內參，應用SYBR Green熒光染料進行real-time PCR反應，獲得各組織標本的擴增曲線，計算機分析Ct值。基于Ct值來評估檢測樣品變化的相對值。

1.4 酶聯免疫吸附法

血清中IL-32蛋白表達水平用美國Biolegend公司的酶聯免疫吸附法試劑盒檢測，具體步驟按說明書操作。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UC患者外周血中IL-32 mRNA表達增高

UC組IL-32mRNA表達水平為（3.07±0.29），對照組為（1.00±0.12），經t檢驗，差異有統計學意義（t=6.157，P=0.009），UC組IL-32 mRNA表達水平高于對照組。見圖1。

2.2 UC患者外周血中IL-32蛋白表達增高

UC組IL-32蛋白表達水平為（156.67±23.33）pg/ml，對照組為（48.337±4.41）pg/ml，經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.562，P=0.010），UC組IL-32蛋白表達水平高于對照組。見圖2。

2.3 不同病情程度UC患者血清IL-32表達水平比較

輕度患者血清IL-32表達水平為（116.67±15.28）pg/ml，中度患者為（153.33±15.26）pg/ml，重度患者為（223.34±25.17）pg/ml，經方差分析，差異有統計學意義（F=24.030，P=0.001），重度患者IL-32表達水平高于輕、中度患者。

圖1 兩組患者外周血中IL-32 mRNA表達水平（±s）

圖2 兩組患者外周血中IL-32蛋白表達水平（±s）

3 討論

本研究發現UC患者外周血中IL-32表達水平升高，且IL-32表達水平隨著UC病情嚴重程度增加而升高。UC是一種炎癥性腸病，主要特點是直腸、乙狀結腸等反復發作的炎癥，可引起癌變、出血等并發癥，其發病機制尚未完全明確。目前研究認為，免疫調節異常在UC發病中發揮重要作用。細胞因子在免疫調節中起關鍵作用，細胞因子表達異常與多種免疫性疾病的發病密切相關。比如風濕性關節炎患者關節腔中IL-32表達增高，與風濕性關節炎的發病密切相關[4]。因此，筆者推測IL-32可能參與UC的發病。

IL-32是一種新發現的促炎癥細胞因子，可以通過活化NF-κB、AP-1、p38MAPK信號通路，誘導單核細胞、巨噬細胞、上皮細胞等表達TNF-α、IL-6、IL-8及白細胞介素1β等細胞因子，而白細胞介素1β、TNF-α及干擾素-γ等細胞因子均可誘導腸上皮細胞等表達IL-32，相互影響導致腸內細胞因子網絡活化，免疫調節異常，最終導致炎癥性腸損傷，發生炎癥性腸病[2-3，7-8]。

最新研究發現，腸上皮細胞表達IL-32，炎癥性腸病腸組織中IL-32表達升高，認為促炎癥細胞因子IL-32可能涉及炎癥性腸病的發病[7-8]。本研究發現，UC患者外周血中IL-32表達升高，且表達水平隨病情嚴重程度增加而升高，因此筆者認為IL-32可能參與UC發病，筆者的研究進一步證實IL-32在UC發病中的作用。

綜上所述，本研究發現UC患者外周血中IL-32表達升高，且IL-32表達水平隨著UC病情嚴重程度增加而升高，因此筆者認為IL-32可能參與UC的發病。

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（童穎丹 編輯）

Expression of serum IL-32 level in patients with ulcerative colitis and its significance

Liang Chen1, Qi-bin Wang1, Rong-kun Dong1, Jian-peng Huang2, Biao Wang1,Jian Zhang1, Pei Wang1, Yun-hui Gan1, Zheng Zhang1, Jun Liang1
(1. Department of Gastrointestinal Surgery, Renmin Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan,Hubei 442200, China; 2. Department of Gastrointestinal Surgery, the Seventh Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Shenzhen, Guangdong 518107, China)

ObjectiveTo investigate serum IL-32 level in patients with ulcerative colitis (UC) and its relationship with the severity of UC.MethodsFifty UC patients (16 mild cases, 20 moderate cases and 14 severe cases) and 30 healthy controls were enrolled in the present study. Peripheral blood of the UC patients and the healthy controls was collected respectively. Total RNA in PBMCs was extracted by TRIzol Reagent. IL-32 mRNA expression level was detected by real-time PCR. IL-32 protein expression level in serum was assayed by ELSIA.Difference in IL-32 expression level between the UC and control groups was compared using student’sttest.Differences in IL-32 expression level among the mild, moderate and severe UC groups were compared using analysis of variance.ResultsSerum IL-32 expression level of the UC patients was higher than that of the healthy controls both at RNA and protein levels (P＜ 0.05). Serum IL-32 expression in the severe UC group was statistically higher than that in the moderate and mild UC groups, respectively (P＜ 0.05).ConclusionsSerum IL-32 expression in UC patients is increased. IL-32 might be involved in the pathogenesis of UC.Keywords: ulcerative colitis; IL-32; peripheral blood

R574.62

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.29.020

1005-8982（2017）29-0094-03

2016-03-07

黃建朋，E-mail：aiabao999@163.com