遠志皂苷對APP/PS1 雙轉基因小鼠海馬神經細胞線粒體的保護作用

帥智峰 韓麗君 弓 箭 王俊蘋 李公啟 吳淑琴 董海影

(齊齊哈爾醫學院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

遠志皂苷對APP/PS1 雙轉基因小鼠海馬神經細胞線粒體的保護作用

帥智峰 韓麗君 弓 箭 王俊蘋 李公啟 吳淑琴 董海影

(齊齊哈爾醫學院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的觀察遠志皂苷對APP/PS1 雙轉基因小鼠海馬神經細胞線粒體功能的調控，探討遠志皂苷的神經保護作用機制。方法將APP/PS1 雙轉基因小鼠分為模型組，遠志皂苷低、中和高劑量組(18.5、37.0和74.0 mg·kg-1·d-1)，選同月齡C57BL/6小鼠為空白對照組，采用免疫熒光檢測海馬神經細胞線粒體膜電位，流式細胞術檢測細胞凋亡率，比色法等檢測超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力和丙二醛(MDA)含量。結果與空白對照組相比，模型組線粒體膜電位降低，神經細胞凋亡率增高，SOD，過氧化氫酶(CAT)和(GSH-PX)活性明顯降低，MDA 含量明顯增高；與模型組相比，遠志皂苷各劑量組的線粒體膜電位升高，神經細胞凋亡率下降，SOD，CAT 和GSH-PX活性明顯升高，MDA 含量明顯降低(Plt;0.05)。結論遠志皂苷可能通過調控線粒體功能，發揮保護海馬神經元的作用。

遠志皂苷；APP/PS1；線粒體

阿爾茨海默病(AD)是一種以進行性認知功能減退為特征的中樞神經系統退行性疾病，迄今為止發病機制尚不十分清楚，藥物的療效也不十分明確〔1〕。遠志為遠志科多年生草本植物，最早記載于《神農本草經》，其性溫，味苦、辛，具有抗氧化、抗衰老、抗癡呆和腦保護作用等多種生理活性〔2〕。遠志的主要藥理活性成分為遠志皂苷(TEN)，現代藥理學研究發現，TEN具有防治AD的作用〔3，4〕。本文主要探討TEN對APP/PS1 雙轉基因小鼠海馬神經細胞線粒體功能的調控，探討TEN的神經保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 TEN由南京景竹生物科技有限公司提供(CAS：JZ20160327A)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)均由南京建成生物工程研究提供(批號：20150422、20150423、20150423和20150417)。

1.2動物 APP/PS1 雙轉基因小鼠(南京生物醫藥研究院，編號D000268)，4月齡，50只均為雄性；C57BL/6J小鼠10只。所有小鼠均飼養于齊齊哈爾醫學院實驗動物中心SPF級飼養室。

1.3方法

1.3.1分組和給藥 將APP/PS1雙轉基因小鼠分為模型組，TEN低、中和高劑量組(18.5、37.0和74.0 mg·kg-1·d-1)，選同月齡C57BL/6小鼠為空白對照組，空白對照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，1次/d，連續灌胃2 w。

1.3.2海馬線粒體制備 末次行為學測試結束后，在冰臺上分離海馬組織，置于勻漿器中，加入適量的0～4℃線粒體分離介質，制備勻漿，離心取上清，再離心取沉淀，加入分離介質，離心取沉淀，加入分離介質，獲取線粒體懸液。

1.3.3流式細胞術檢測細胞凋亡率 將獲取的線粒體懸液加入熒光染色液，然后進行避光孵育，用流式細胞儀分析。

1.3.4SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA 含量的檢測 將獲取的線粒體懸液用酶標法檢測SOD，硫代巴比妥酸法檢測MDA，分光光度法檢測CAT，比色法檢測GSH-PX。

1.3.5免疫熒光檢測海馬神經細胞線粒體膜電位 取新鮮海馬組織樣本并壓平，清洗后浸入染色液，置于37℃培養箱孵育，抽去染色液，清洗后切片，鏡下觀察拍照。

1.4統計方法 采用SPSS16.0軟件，組間比較用單因素方差分析。

2 結 果

2.1TEN對各組腦組織海馬神經細胞凋亡率的影響 與空白對照組〔(4.97±0.27)%〕比較，模型組細胞凋亡率〔(35.22±8.05)%〕明顯增高(Plt;0.05)；與模型組相比，TEN高、中、低劑量組〔(7.59±0.96)%,(8.04±1.09)%,(17.73±3.34)%〕均能明顯降低細胞凋亡率 (Plt;0.05)，且TEN高、中劑量組間相比差異無統計學意義(Pgt;0.05)。

2.2免疫熒光檢測各組線粒體細胞膜電位的變化 與空白對照組比較，模型組細胞膜電位下降(紅色熒光明顯減少，綠色熒光增加)，與模型組相比，TEN低劑量組紅色熒光增加，中劑量組和高劑量組的紅色熒光明顯增強，說明線粒體膜電位開始回升。見圖1。

2.3TEN對腦組織SOD、CAT、GSH-PX活力和MDA 含量的影響 與空白對照組比較，模型組腦組織SOD、CAT、GSH-PX活性明顯降低，MDA 含量明顯增高(Plt;0.05)；與模型組比較，TEN高、中劑量組均能明顯升高SOD、CAT、GSH-PX活性(Plt;0.05)，TEN高、中劑量組均能明顯降低MDA 含量(Plt;0.05)，且呈現劑量依賴效應；上述參數TEN高、中劑量組間比較無明顯差異(Pgt;0.05)。見表1。

圖1 線粒體細胞膜電位變化(×200)

組別GSH-PX(U/mg)MDA(nmol/mg)SOD(U/mg)CAT(U/mg)空白對照組609.69±45.597.75±1.3633.59±3.0830.89±2.81模型組314.61±54.311)15.17±4.771)17.30±2.151)13.12±1.081)TEN低劑量組403.77±27.831)12.37±2.1621.28±3.102)19.76±3.372)TEN中劑量組515.04±33.342)8.59±2.072)27.48±2.782)24.72±3.072)TEN高劑量組567.28±48.922)8.08±1.752)26.55±3.562)23.31±2.752)

與空白對照組比較：1)Plt;0.05；與模型組比較：2)Plt;0.05

3 討 論

AD病因學研究發現，神經細胞線粒體結構缺陷和功能改變是導致AD 病人腦內神經細胞凋亡的重要因素，線粒體對細胞凋亡發揮著中心調控作用〔5〕。線粒體是由外膜、內膜、膜間隙和基質構成的封閉囊狀結構。線粒體氧化磷酸化產生的能量是維持腦內神經元正常功能的必須要素。線粒體的基本功能就是通過氧化磷酸化為細胞生命活動提供必需能量，其產生能量的過程主要依賴跨膜電位，線粒體基質內的質子由質子泵進入內外膜間隙，形成橫跨線粒體內膜的線粒體跨膜電位，從而在ATP 合酶的作用下生成ATP〔6〕。線粒體膜電位是生物膜兩側離子濃度不同產生的跨膜電位差，可以作為評價線粒體功能的敏感指標〔6〕。當膜電位下降時，就會引起線粒體氧化磷酸化效率下降，進而生成大量的氧自由基，導致細胞損傷與凋亡〔7〕。對抗活性氧簇(ROS)的抗氧化防御體系包括酶系統，如SOD、GSH和CAT，這些酶代表著機體的第一道抗氧化防御體系。其中SOD是體內天然存在的氧自由基清除劑，其活性的高低可以作為機體清除氧自由基能力的指標，而GSH是機體內重要的抗氧化劑，能夠清除自由基，發揮抗氧化作用；MDA是體內的脂質代謝產物，是脂質過氧化的主要降解產物，其含量的高低可以作為機體細胞受自由基攻擊程度的指標〔8〕。

現代藥理學研究發現，益智中藥遠志的有效成分具有抗癡呆、御氧化和防衰老等藥理活性〔9〕。本文研究結果顯示，TEN能顯著抑制APP/PS1 雙轉基因小鼠神經細胞凋亡，在改善線粒體膜電位的同時還能顯著抑制SOD、CAT和GSH活性并MDA含量，呈現劑量依賴效應，治療效果最佳濃度為74.0 mg·kg-1·d-1。可見，TEN對線粒體的功能具有較好的保護作用，可能與其通過維持線粒體膜電位的穩定性，保持線粒體氧化磷酸化的偶聯程度，提高抗氧化酶活性與減少自由基的產生，抑制細胞凋亡的作用機制有關。

1官 杰，李 浩，劉建剛，等.還腦益聰方組分對APP轉基因小鼠腦組織炎癥因子和氧化應激的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2011；27(4)：732-8.

2滕紅梅，胡正海.遠志的生物學及化學成分研究進展〔J〕.中草藥,2007；38(8)：1276-9.

3陳 勤，陳逸青，葉海燕，等.遠志皂苷通過UPP 通路清除AD 大鼠腦神經細胞代謝廢物積聚的作用機制研究〔J〕.中國中西醫結合雜志，2015；35(3)：327-32.

4黃 炎，陳逸青，陳 勤，等.遠志皂苷對Aβ1-40 誘導癡呆大鼠海馬神經細胞線粒體的保護作用〔J〕.中藥藥理與臨床，2015；31(1)：93-7.

5Han XJ，Tomizawa K，Fujimura A，etal. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases〔J〕.Acta Med Okayama，2011；65(1)：1-10.

6Ly JD，Grubb DR，Lawen A.The mitochondrial membrane potential(Δψm) in apoptosis，an update〔J〕.Apoptosis，2003；8(2)：115-28.

7Fariss MW,Chan CB，Patel M，etal.Role of mitochondria in toxic oxidative stress〔J〕.Mol Interv，2005；5(2)：94-11.

8Tarozzi A，Angeloni C，Malaguti M，etal.Sulforaphane as a potential protective phytochemical against neurodegenerative diseases〔J〕.Oxid Med Cell Longev，2013;2013：415078.

9葉海燕，陳 勤.遠志皂苷對Aβ1-40 誘導的AD 大鼠學習記憶功能障礙的保護作用機制研究〔J〕.中國新藥雜志，2013；22(22)：2674-8.

〔2017-02-28修回〕

(編輯 郭 菁)

ProtectiveeffectofsengeninonhippocampusneuronalmitochondriaofAPP/PSIdoubletransgenicrat

SHUAIZhi-Feng,HANLi-Jun,GONGJian,etal.

PathologyDiagnosisCenterQiqiharMedicalUniversity,Qiqihaer161006,Heilongjiang,China

ObjectiveTo observe the regulation of the sengenin on APP/PSI double transgenic rats' hippocampus neuronal mitochondria, explore the protection of the sengenin to the nerves.MethodsAPP/PSI double transgenic rats were divided into model, sengenin high, middle and low dose groups(18.5, 37.0 and 74.0 mg·kg-1·d-1), the same month old C57BL/6 rats were chosen as the control group. Hippocampus neuronal mitochondria potential was detected by immunofluorescence, cell apoptotic rate was measured by flow cytometry, SOD, GSH-PX activity and MDA content were detected by colorimetry.ResultsCompared with control group, mitochondrial membrane potential was decreased, the apoptotic rate of neuron cell was increased, the activity of SOD，CAT and GSH-PX were decreased significantly, the content of MDA of model group was increased significantly. Compared to model group, the mitochondrial membrane potential was increased, the apoptotic rate of neuron cell was decreased, the activity of SOD, CAT and GSH-PX were increased, the content of MDA was decreased significantly in each sengenin group (allPlt;0.05).ConclusionsSengenin could protect the function of hippocampal neurons by regulating mitochondria function.

Sengenin; APP/PS1; Mitochondrion

R745.1

A

1005-9202(2017)22-5493-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.004

國家自然科學基金青年項目(No.81403131)；黑龍江省普通本科高等學校青年創新人才培養計劃(UNPYSCT-2015107)

董海影(1982-)，女，博士，講師，主要從事神經精神疾病的病理學研究。

帥智峰(1982-)，女，碩士，講師，主要從事神經精神疾病的病理學研究。