右美托咪定對過氧化氫引起的PC12細胞損傷的保護作用

鄭輝哲 王 英 張 援

(福建省腫瘤醫(yī)院 福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，福建 福州 350014)

右美托咪定對過氧化氫引起的PC12細胞損傷的保護作用

鄭輝哲 王 英 張 援

(福建省腫瘤醫(yī)院 福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，福建 福州 350014)

目的探討右美托咪定對過氧化氫(H2O2)引起的PC12細胞損傷的保護作用。方法PC12細胞隨機分為正常對照組，H2O2組(200 μmol/L H2O2)，右美托咪定低、中、高濃度組(50、100、200 μmol/L右美托咪定+200 μmol/L H2O2)，培養(yǎng)48 h，分別檢測細胞活力、凋亡情況、天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3、Caspase9活性、乳酸脫氫酶(LDH)釋放量，丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2及Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)蛋白表達、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2磷酸化水平。結(jié)果與H2O2組比較，右美托咪定低、中、高濃度組細胞活力顯著提高，細胞早期及晚期凋亡率顯著降低，LDH釋放量顯著減少，MDA含量顯著降低，SOD、CAT及GSH-Px活性顯著升高，Caspase3、9活性顯著降低，Bcl-2及p-ERK1/2表達量顯著上調(diào)，Bax表達量顯著下調(diào)(均Plt;0.01)。結(jié)論右美托咪定能通過抗氧化及抗細胞凋亡進而抑制H2O2引起的PC12細胞損傷。

右美托咪定；PC12細胞；過氧化氫(H2O2)；損傷

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡是阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病、腦缺血、腦缺血再灌注損傷等病理性腦神經(jīng)損傷的重要原因〔1〕。過氧化氫(H2O2)，誘導(dǎo)的PC12細胞損傷是目前研究神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激損傷常見的細胞模型〔2〕。右美托咪定能夠促使細胞表面α2腎上腺受體與抑制性G蛋白耦聯(lián)，進而傳遞細胞內(nèi)信號，使機體產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)，在臨床上被廣泛應(yīng)用于鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗焦慮的治療〔3〕。目前研究還發(fā)現(xiàn)右美托咪定具有顯著的神經(jīng)保護作用，如對利多卡因、谷氨酸及化學(xué)性低氧誘導(dǎo)的PC12細胞損傷具有顯著的保護作用〔4～6〕，但對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞損傷是否具有保護作用尚未見報道，本研究對此展開探討。

1 材料與方法

1.1一般材料 細胞、大鼠PC12細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫。主要試劑與儀器、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購自碧云天生物技術(shù)研究所；噻唑藍(MTT)購自美國Gibco公司；Annexin V/PI流式雙染試劑盒，水解酶(Caspase)3、9活性檢測試劑盒均購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；兔抗，B淋巴細胞瘤(Bcl)-2，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax),細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2及p-ERK1/2多克隆抗體均購自美國Abcam公司；超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)，過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒均購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司。DYCZ-425D型雙垂直電泳儀，DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購自北京六一儀器廠；MK3酶標儀購自美國thermo公司；168-1000XC型酶標儀均購自美國BD公司。

1.2實驗分組及給藥 取生長對數(shù)期PC12細胞隨機分為正常對照組，H2O2組，右美托咪定低、中、高濃度組；H2O2組及右美托咪定組預(yù)先給予200 μmol/L的H2O2進行誘導(dǎo)24 h，接著右美托咪定組分別給予50、100、200 μmol/L的右美托咪定，正常對照組及模型組均給予等體積培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.3噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力 將PC12細胞接種到96孔板，24 h后，按1.2分組及給藥后，每個96孔均加入終濃度為20 μl的MTT孵育4 h，翻轉(zhuǎn)96孔板，棄去上清液，接著每孔加入150 μl的二甲基亞砜，使沉淀物溶解并于微量振蕩器震蕩10 min，最后于酶標儀570 nm處測定OD值。

1.4比色法檢測細胞中Caspase3、9活性 將PC12細胞接種到6孔板，24 h后，按1.2分組及給藥后，0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集細胞并裂解，收獲上清液后按照Caspase3、9試劑盒說明書檢測其活性，酶標儀405 nm處測定OD值，OD值即代表Caspase3活性。

1.5細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放量、MDA含量及SOD、CAT及GSH-Px活性的檢測 將PC12細胞接種到6孔板，24 h后，按1.2分組及給藥后，0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集細胞并裂解，收獲上清液后，分別按照試劑盒采用比色法檢測LDH釋放量及GSH-Px活性，硫代巴比妥酸(TBA)法檢測MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，鉬氨酸比色法檢測CAT活性。

1.6Western印跡檢測細胞Bax，Bcl-2及p-ERK1/2蛋白表達 將PC12細胞接種到6孔板，24 h，按1.2分組及給藥后，在冰浴條件下刮下細胞，裂解獲得細胞上清液即是總蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，蛋白變性。制作濃縮膠和分離膠，蛋白樣品上樣，進行十二烷基硫酸鈉凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，一抗溶液(兔抗Bax，Bcl-2，ERK1/2及p-ERK1/2多隆抗體，小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋度皆為1∶100)孵育，4℃過夜；二抗室溫孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1右美托咪定對H2O2的PC12細胞活力的影響 與正常對照組(0.68±0.07)比較，H2O2組(0.33±0.03)細胞活力顯著降低(Plt;0.01)；與H2O2組比較，右美托咪定低、中、高濃度組〔(0.46±0.04)，(0.57±0.05)，(0.68±0.06)〕細胞活力顯著上升(Plt;0.01)。

2.2右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的影響 與正常對照組比較，H2O2組早期及晚期細胞凋亡率顯著提高(Plt;0.01)；與H2O2組比較，右美托咪定低、中、高濃度組早期及晚期細胞凋亡率顯著降低(Plt;0.01)。見表1。

2.3右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中LDH釋放量、MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性的影響 與正常對照組比較，H2O2組LDH釋放量顯著增加，MDA含量升高，SOD、CAT及GSH-Px活性顯著降低(Plt;0.01)；與H2O2組比較，右美托咪定低、中、高濃度組LDH釋放量顯著減少，MDA含量顯著降低，SOD、CAT及GSH-Px活性顯著升高(Plt;0.01)。見表2。

表1 右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的影響

與正常對照組比較：1)Plt;0.01；與H2O2組比較：2)Plt;0.01，下表同

表2 右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中LDH釋放量、MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活性的影響

2.4右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中Caspase3、9活性的影響 與正常對照組比較，H2O2組Caspase3、9活性顯著提高(Plt;0.01)；與H2O2組比較，右美托咪定低、中、高濃度組Caspase3、9活性顯著降低(Plt;0.01)。見表3。

2.5右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中Bax及Bcl-2表達的影響 與正常對照組比較，H2O2組Bcl-2表達量顯著下調(diào)，Bax表達量顯著上調(diào)(Plt;0.01)；與H2O2組比較，右美托咪定低、中、高濃度組中Bcl-2表達量顯著上調(diào)，右美托咪定中、高濃度組中Bax表達量顯著下調(diào)(Plt;0.01)。見表4，圖1。

表3 右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中Caspase3、Caspase9活性的影響

2.6右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中ERK1/2磷酸化水平的影響 與正常對照組比較，H2O2組中p-ERK1/2表達量顯著上調(diào)(Plt;0.01)；與H2O2組比較，右美托咪定低、中、高濃度組中p-ERK1/2表達量顯著下調(diào)(Plt;0.01)。見表4，圖2。

表4 右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中Bax、Bcl-2及p-ERK1/2/ERK1/2表達的影響

A：正常對照組；B：模型組；C～E：右美托咪定低濃度組、中濃度組、高濃度組；下圖同圖1 右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中Bax及Bcl-2表達的影響

圖2 右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中ERK1/2磷酸化水平的影響

3 討 論

氧化應(yīng)激是機體由于抗氧化能力減弱，氧化作用增強，產(chǎn)生大量活性氧使得機體處于不同程度的氧化應(yīng)激損傷，如細胞膜過脂質(zhì)化，細胞毒性作用，蛋白的異常表達等〔1〕。PC12細胞是一種來源于大鼠腎上腺嗜絡(luò)細胞瘤的細胞，與神經(jīng)元的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能異常相似，因此被常用來作為研究神經(jīng)生長、分化、凋亡、損傷等的模型細胞〔2〕。本研究參照相關(guān)文獻〔2〕，結(jié)果說明H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激模型成功。右美托咪定是一種α2腎上腺受體激動劑，α2受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，因此右美托咪定能夠通過激動突觸前膜及后膜的α2受體，進而抑制去甲腎上腺素的釋放及交感神經(jīng)活性，從而使機體產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用〔3〕。目前研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定還能顯著抑制利多卡因、谷氨酸及化學(xué)性低氧誘導(dǎo)的PC12細胞損傷〔4～6〕。本研究結(jié)果表明右美托咪定能顯著提高H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞活力，并降低細胞凋亡率，與右美托咪定提高利多卡因、谷氨酸及化學(xué)性低氧誘導(dǎo)的PC12細胞活力結(jié)果一致〔4～6〕，提示右美托咪定對H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡具有顯著的抑制作用。LDH是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一，其含量升高是細胞受損的重要標記〔7〕。MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其活性升高說明細胞膜受到氧化應(yīng)激損傷〔8〕。SOD、CAT及GSH-Px是細胞內(nèi)抗氧化作用酶，其活性降低說明細胞抗氧化作用降低〔9〕。本研究表明右美托咪定可以通過抗氧化應(yīng)激抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞損傷。

細胞的凋亡受細胞凋亡基因的調(diào)控，其中Bcl-2家族蛋白最為常見。Bcl-2是研究較為廣泛的抑制凋亡蛋白，能夠與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號傳遞，促進細胞存活與生長。而Bax還能夠自身形成二聚體，將凋亡信號傳遞給Caspase家族，使Caspase家族產(chǎn)生級聯(lián)放大反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡。Caspase家族接收到上游凋亡信號后，起始Caspase9將信號逐級傳遞并最終傳遞給Caspase3，導(dǎo)致DNA斷裂，細胞膜破裂，最終引起細胞凋亡。而細胞的生長、增殖、分化、凋亡等過程受多種信號通路的調(diào)控，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路就是其中一種〔10〕。MAPK包括5個亞族，其中ERK是與細胞增殖、凋亡最為密切相關(guān)的亞族。ERK1/2在正常生理條件下處于細胞質(zhì)中，當(dāng)受到上游蛋白激活后，ERK1/2轉(zhuǎn)入細胞核中，調(diào)控相關(guān)蛋白表達，參與細胞的增殖、凋亡等生物學(xué)行為。同時有研究證實H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞中Caspase3、9活性提高，Bax表達量上調(diào)，Bcl-2表達量下調(diào)，ERK1/2磷酸化水平提高〔8，9，11〕，因此當(dāng)阻斷此過程能一定程度上的抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。本研究結(jié)果表明，右美托咪定能顯著的降低Caspase3、9活性，上調(diào)Bcl-2及p-ERK1/2表達，下調(diào)Bax表達，最終抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。

總之，右美托咪定能顯著的抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞損傷，與右美托咪定抗氧化應(yīng)激及抗細胞凋亡有關(guān)。

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〔2017-04-21修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

ProtectiveeffectofdexmedetomidineonPC12cellinjuryinducedbyH2O2

ZHENGHui-Zhe,WANGYing,ZHANGYuan.

DepartmentofAnesthesiology,FujianCancerHospitalamp;FujianMedicalUniversityAffiliatedCancerHospital,Fuzhou350014,Fujian,China

ObjectiveTo explore protective effect of dexmedetomidine on PC12 cell injury induced by H2O2.MethodsPC12 cell was randomized into normal control, H2O2(200 μmol/L H2O2), dexmedetomidine low, medium and high-dose groups (50, 100, 200 μmol/L dexmedetomidine +200 μmol/L H2O2) and was cultured for 48 h. Cell viability, cell apoptosis, the activity of cysteinyl aspartate specific proteinase (Caspase) 3, Caspase9, lactate dehydrogenase (LDH) release, malondialdehyde (MDA) content, the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px), the expression of B-cell lymphoma (Bcl)-2, Bcl-2 associated X protein (Bax), phosphorylation of extracellular regulated protein kinases 1/2 (ERK1/2) were measured.ResultsCompared with H2O2group, cell viability was increased (Plt;0.01), the cell apoptosis rate, the activity of Caspase3, Caspase9, LDH release and MDA content were reduced (Plt;0.01), the activity of SOD, CAT and GSH-Px were increased (Plt;0.01), the expression of Bcl-2 and p-ERK1/2 were up-regulated (Plt;0.01), the expression of Bax was down-regulated (Plt;0.01) in dexmedetomidine low, medium and high-dose groups.ConclusionsDexmedetomidine suppresses PC12 cell injury induced by H2O2via anti-oxidation and anti-apoptosis.

Dexmedetomidine; PC12 cell; H2O2; Injury

R614

A

1005-9202(2017)22-5500-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.007

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(No.81400921)；人社部2016年度留學(xué)人員科技活動項目擇優(yōu)資助項目(2016年)

鄭輝哲(1971-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事麻醉和疼痛治療研究。