當歸揮發油對自發性高血壓大鼠ACE2基因表達的影響

伊 琳 曲 強 紀祿風 石向慧 王立紅 顧遠暉

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

當歸揮發油對自發性高血壓大鼠ACE2基因表達的影響

伊 琳 曲 強1紀祿風 石向慧 王立紅 顧遠暉1

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

目的探討當歸揮發油對自發性高血壓大鼠(SHR)心肌血肌緊張素轉換酶(ACE)2基因表達的影響及作用機制。方法將40只8周齡雄性SHR隨機分為模型組，當歸揮發油組(低、高)和卡托普利組，并以同周齡的Wistar大鼠作為正常對照組。分別灌胃4 w后，取大鼠心肌組織，HE染色觀察心肌組織形態學的變化實時熒光定量PCR法檢測ACE2 mRNA 表達量，Western印跡檢測ACE2蛋白的表達水平。結果當歸可降低SHR血壓；HE染色顯示，與模型組相比較，當歸揮發油各組病變分別有不同程度的減輕；與模型組相比，當歸高、低劑量組ACE2 mRNA及蛋白表達水平均明顯升高(Plt;0.01)。結論當歸揮發油對SHR血壓有調節作用，可能通過ACE2基因發揮降壓作用。

當歸揮發油;高血壓;血管緊張素轉換酶(ACE)2

腎素-血管緊張素系統(RAS)過度活動是人類原發性高血壓的主要發病機制之一。近年研究發現，RAS 中存在一個拮抗血管緊張素轉換酶(ACE)/血管緊張素(Ang)Ⅱ/血管緊張素1受體(AT1R) 軸的平衡系統即ACE2/Ang1～7/Mas 受體軸，其中ACE2為關鍵基因〔1〕，在高血壓的發生、發展中起重要作用。當歸揮發油是當歸的脂溶性成分，包含藁本內酯、正丁烯內酯、當歸酮等，其中藁苯內酯含量最高。當歸揮發油具有降壓作用，本研究將探討當歸對ACE2基因表達的影響。

1 材料和方法

1.1動物選擇與分組 40只8周齡雄性自發性高血壓大鼠(SHR)(體重180～220 g)，SPF級,購自北京維通利華實驗動物有限責任公司〔動物合格證號SCXK(京)2012-0001〕，動物檢疫合格證明No.1100562901)。8只正常血壓 Wistar 大鼠(體重180～220 g)，雄性，SPF級，購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心〔動物合格證號SYXK(甘)2011-0001〕。

1.2藥物與試劑選擇 當歸購自甘肅省岷縣，由甘肅中醫藥大學科研實驗中心提取揮發油，采用CO2超臨界萃取法；卡托普利分散片(國藥準字H41025659)；高效RIPA裂解液，BCA濃度測定試劑盒，聚丙酰胺配膠試劑盒(索萊寶)；Western印跡儀(伯樂美國)，Power Lab ML125/R無創尾動脈血壓器(日本)，低溫搖床，低溫離心機。

1.3給藥方法和分組 將SHR和Wistar大鼠在SPF級實驗室適應性飼養1 w后，于給藥前測定各組大鼠的血壓，采用Power Lab ML125/R無創血壓測定分析系統測定清醒狀態下鼠尾動脈收縮壓，連續測定1 w，待各組大鼠適應環境后，將SHR隨機分為模型組、卡托普利組、當歸低劑量與高劑量組，Wistar 大鼠為對照組，每組8只。給藥途徑為灌胃。模型組和對照組給予生理鹽水，不給任何藥物。當歸組、卡托普利組根據實驗鼠體表面積最終確定給藥劑量，當歸低、高組分別每日為當歸揮發油1.2、10 g/kg，卡托普組每日產卡和普利2.25 mg/kg。每周給藥7 d，每天定時給藥，連續4 w，隨體重變化每周按時調整給藥劑量。每周的第七天于同一時間測定血壓，每只大鼠每次測定5次，取均值。試驗期間，各組大鼠標準飲食，自由飲水。

1.4樣本采集 給藥4 w后，將動物禁食不禁水12 h，3%水合氯醛(避光)腹腔注射麻醉后于腹主動脈取血8 ml，3 000 r/min 離心 10 min(4℃),分離血清。將大鼠頸椎脫臼處死，開胸取出心肌組織，部分心肌組織立即置于液氮保存；另一部分心肌組織置入10%甲醛溶液中固定、脫水透明及石蠟包埋切片，HE 染色，觀察血管組織形態學變化。

1.5實時熒光定量PCR檢測ACE2 mRNA的表達量 按 Trizol試劑盒說明書抽取組織總RNA，按 RT-PCR 試劑盒說明書配置逆轉錄反應體系合成 cDNA，然后進入PCR 擴增體系，反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃，50 s；50個循環；72℃ 8 min；觀察擴增曲線和溶解曲線，溶解曲線以單峰為佳,以β-actin 為內參基因，采用2-ΔΔCt法，按照相對表達量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=實驗組 ΔCt-對照組 ΔCt，ΔCt=目的基因 Ct平均值-β-actin Ct平均值，分析各組基因的相對表達水平。

1.6Western印跡檢測ACE2蛋白表達水平 各組大鼠處死后，PBS水沖洗后，取心肌組織200 mg，加500高效裂解液(含1%PSMF)冰上裂解20 min，4℃離心后得上清為總蛋白，95℃水浴鍋煮10 min，同時采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，根據蛋白濃度計算上樣量，隨后進行免疫印跡檢測。以GAPDH作為內參照，進行半定量分析，比值表示其相對含量。

1.7統計學方法 采用SPSS20.0軟件，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用ANOVA方差分析，并行兩兩比較。

2 結 果

2.1各組用藥前后血壓的變化 模型組收縮壓顯著高于對照組(Plt;0.01);連續灌服當歸揮發油，當歸組(高、低)血壓明顯低于模型組(Plt;0.01)，卡托普利組血壓低于模型組(Plt;0.01)，當歸各組(高、低)內未見明顯差異(Plt;0.01)。見圖1。

2.2HE染色結果 心肌組織病理切片結果顯示，模型組與對照組相比，心肌纖維增粗，排列較紊亂，橫紋結構模糊，毛細血管比例相對減少。與模型組比較，卡托普利組肌纖維排列比較均勻，且肌纖維變細；與模型組比較，當歸揮發油高劑量組橫紋肌結構清晰，心肌纖維排列更加均勻且肌纖維變細。見圖2。

與對照組相比：1)Plt;0.01；與模型組相比：2)Plt;0.01圖1 當歸揮發油對鼠尾動脈壓的影響

圖2 心肌組織病理切片(HE，×400)

2.3各組ACE2 mRNA表達水平比較 與模型組相比，當歸揮發油低劑量組ACE2 mRNA與高劑量組表達水平均升高(Plt;0.01)。

2.4Western印跡檢測ACE2蛋白表達水平 與模型組相比，ACE2蛋白表達水平在當歸揮發油各組均升高(Plt;0.01)，見圖3。

1～5：對照組、模型組、卡托普利組、當歸揮發油低劑量組、當歸揮發油高劑量組圖3 Western印跡電泳結果

3 討 論

在世界范圍內，心血管疾病(CAD)位于所有疾病死亡之首位，在所有心血管疾病中，原發性高血壓是最主要的危險因素。同時高血壓的知曉率、治療率、控制率均不滿意，對高血壓的防治仍面臨嚴重的挑戰。有關高血壓發病機制的研究一直在深入進行中，原發性高血壓是遺傳因素和環境因素共同作用所致的復雜性疾病，其中遺傳因素在EH的發病機制中的影響占30%～50%。新近研究表明，miRNA、DNA甲基化，組蛋白修飾及基因組結構變異等都有可能參與血壓調節和高血壓的發生〔2〕。ACE2基因位于染色體Xp22，2002 年加拿大學者 Crackower等〔3〕報道ACE2 基因定位于 X 染色體上，是高血壓的候選基因之一〔4〕。Yagil等〔5〕基于對ACE2的認識首先提出了有關RAS調節血壓的“兩臂學說”，其中一個臂依賴于ACE的活性與AngⅡ產生，另一個臂則依賴于ACE2的活性與Ang(1～7)的生成，二者相互拮抗，共同參與血壓的調節，ACE2最重要的生物學效應是降解AngⅡ生成Ang(1～7)，其中ACE2催化AngⅡ生成Ang(1～7)的效率是催化AngI生成Ang(1～9)效率的400倍。一方面，ACE2通過對AngⅡ的降解來限制它的血管收縮功能，另一方面，通過Ang(1～7)的生成拮抗AngⅡ的作用，Ang(1～7)具有擴張血管及抗纖維化的功能〔6〕。組織中ACE/ACE2的平衡失調將導致血壓的改變，ACE2表達上調阻止血壓升高，ACE2表達缺失導致血壓升高〔7，8〕。金海燕等〔9〕的研究也發現自發高血壓大鼠心臟 ACE2 基因及蛋白水平明顯減低可同時伴隨血壓的升高。因此，RAS系統中ACE/AngⅡ/AT1R與 ACE2/Ang(1～7)/MasR軸的作用相互拮抗，后者作為內生性的反調控用途拮抗前者功能，當兩者的生理不平衡達到一定程度時，就會導致一些心血管疾病如高血壓的發生。當歸是甘肅的道地藥材，也是中藥治療高血壓使用頻率最高的藥物之一〔10〕。現代醫學通過對當歸提取物發現，當歸提取物通過對RASS系統、離子通道、血管神經等對高血壓的發生發展起到一定的作用。本次研究再次證實當歸具有降壓的作用，當歸揮發油對心肌組織有保護作用，當歸揮發油可能會增強ACE2的活性，作用于ACE2/Ang(1～7)/MasR軸，抑制血管的收縮，拮抗ACE的作用而發揮降壓的作用，下一步研究中將進一步探討當歸對ACE2/Ang(1～7)/MasR軸中其他因素的影響及對相關信號通路的作用，以明確當歸對ACE2/Ang(1～7)/MasR的干預作用。

1De Mello WC.Local renin angiotensin aldosterone systems and cardiovascular diseases〔J〕.Med Clin North Am,2017;101(1):117-27.

2朱鼎良.遺傳因素在原發性高血壓發病中的新進展〔J〕.中國循環雜志,2012;27(2):81-2.

3Crackower MA,Sarao R,Oudit GY,etal.Angiotensin-converting enzyme 2 is an essential regulator of heart function〔J〕.Nature,2002;417(6891):822-8.

4Donoghue M,Hsieh F,Baronas E,etal.A novel angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase(ACE2)converts angiotensin Ⅰ to angiotensin 1-9〔J〕.Circ Res,2000;87(5):E1-9.

5Yagil Y,Yagil C.Hypothesis ACE2 modulates blood pressure in the mammalian organism〔J〕.Hypertension,2003;41(4):871-3.

6Tallant EA,Clark MA.Molecular mechanisms of inhibition of vascular growth by angiotensin-(1-7)〔J〕.Hypertension,2003;42(4):574-9.

7Ocaranza MP,Michea L,Chiong M,etal.Dissociating angiotensin 1-9 anticardiovascular remodeling effects from those on blood pressure〔J〕.J Hypertens,2014;32(8):1719-21.

8Ocaranza MP,Moya J,Barrientos V,etal.Angiotensin-(1-9)reverses experimental hypertension and cardiovascular damage by inhibition of the angiotensin converting enzyme/Ang Ⅱ axis〔J〕.J Hypertens,2014;32(4):771-83.

9金海燕，宋 蓓，鐘久昌. ACE2 基因:高血壓防治新的靶點〔J/CD〕.中華臨床醫師雜志:電子版，2011;5(11):5062-5.

10蔡永敏,王守富,黃謙峰,等.原發性高血壓中藥現代應用頻次研究〔J〕.世界科學技術-中醫藥現代化,2014;10(3):603.

〔2016-11-15修回〕

(編輯 李相軍)

TheeffectsofAngelicaonACE2geneinspontaneouslyhypertensiverats

YILin,QUQiang,JILu-Feng,etal.

GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,Gansu,China

ObjectiveTo study the influence of Angelica sinensis (oliv.) Diels on ACE2 gene in spontaneously hypertensive rats (SHR).MethodsAll the rats were divided into Angelica , model , captopril groups, weekly-old Wistar rats as normal control group, The systolic blood pressure(SBP) of the tail in different groups before and after treatment were measured .After 4 weeks, cardiac tissue of the rats were taken out, HE stain was used to observe the pathological changes of cardiac tissue, the mRNA level of ACE2 was detected by RT-PCR，the protein expression of ACE2 was tested by Western blot.ResultsAngelica reduced SBP in SHRs. Myocardial fibers of Angelica group were thinned and organized with sharply defined stripes structure. The ACE2 mRNA and protein expressions were significant increased in Angelica group (Plt;0.01).ConclusionsThe essential oil of Angelica sinensis could reduce the blood pressure through up-regulating the expression of ACE2.

Angelica; Hypertension; ACE2

R2-031

A

1005-9202(2017)22-5507-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.010

國家自然科學基金(No.81460669)；甘肅省中醫藥管理局項目批準號(GZK-2016-40)；甘肅省自然科學基金(No.1310RJZA084)

1 甘肅省人民醫院

顧遠暉(1969-)，男，主任醫師，主要從事腫瘤相關的臨床與基礎研究。

伊 琳(1971-)，女，副教授，博士，主要從事高血壓遺傳學、中西醫結合心血管疾病研究。