脂多糖介導的TLR4信號通路在膀胱癌免疫逃逸中的作用及其機制

吳高亮 周偉敏 齊雪亮 胡 涌 黃 驥 郝 超

(江西省腫瘤醫院泌尿外科，江西 南昌 330029)

脂多糖介導的TLR4信號通路在膀胱癌免疫逃逸中的作用及其機制

吳高亮 周偉敏 齊雪亮 胡 涌 黃 驥 郝 超

(江西省腫瘤醫院泌尿外科，江西 南昌 330029)

目的探討脂多糖介導的Toll樣受體(TLR)4信號通路活化在膀胱癌(BC)T24細胞系免疫逃逸中的作用及其機制。方法取對數生長期T24細胞，使用1 μg/ml的脂多糖分別刺激該細胞0、6、12、24 h，采用流式細胞儀檢測細胞表面TLR4的表達量，采用RT-PCR檢測細胞中程序性死亡配體-1(PD-1,又稱B7-H1)mRNA的表達，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測細胞中B7-H1 蛋白的表達，分析TLR4表達與B7-H1 mRNA及其蛋白的相關性。結果TLR4陽性率隨刺激時間的增長而上調，且在12 h時達到最高值，24 h時表達略有降低，但仍較高。6、12、24 h時TLR4陽性率與0 h時比較差異有統計學意義(Plt;0.05)。RT-PCR及ELISA結果顯示B7-H1 mRNA及蛋白的表達隨刺激時間的增長而上調，且在12 h時達到最高值，24 h時表達略有降低，但仍較高。與0 h時比較，6 h和24 h T24細胞B7-H1 mRNA及蛋白表達量增高(Plt;0.05)，12 h 顯著增高(Plt;0.01)。TLR4與B7-H1 mRNA呈正相關(r=0.785，P=0.002)，TLR4與B7-H1 蛋白呈正相關(r=0.825，P=0.012)。結論脂多糖能活化TLR4信號通路，并上調B7-H1 mRNA及其蛋白的表達，可能參與BC細胞免疫逃逸，為BC的靶向治療提供新思路。

Toll樣受體4；程序性死亡配體-1；蛋白表達；膀胱癌；免疫逃逸

膀胱癌(BC)是發病率最高的泌尿系統惡性腫瘤，可分為表淺性BC(Ta～1及原位癌Tis)和浸潤性BC(T2～4)兩大類，其中浸潤性BC占總體的80%，具有易發生轉移、預后較差、術后生存率較低等特點〔1〕初次治愈后復發率高達70%～80%。Toll樣受體(TLR)4是一種免疫調節因子，參與機體免疫應答的起始階段，正常情況下僅表達于機體免疫細胞表面，病理狀態下表達于多種惡性腫瘤細胞表面〔2〕。程序性死亡配體(PD)-1又稱B7-H1，可以通過與受體PD-1的結合對某些細胞因子的分泌和T細胞的增殖產生抑制作用，或與腫瘤細胞的免疫逃逸密切相關〔3〕。目前，關于TLR4信號通路和B7-H1在肺癌、套細胞淋巴癌細胞等中的免疫逃逸過程已有報道〔4,5〕，但是在BC細胞中的免疫逃逸機制鮮見報道。本文利用脂多糖介導的TLR4信號通路活化，研究TLR4信號通路和B7-H1在BC免疫逃逸中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細胞及試劑 人BC細胞系T24細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)，青霉素、鏈霉素(Sigma公司)，胎牛血清、胰蛋白酶、培養液 RPMI1640培養基(HyClone 公司)，Trizol reagent(Invitrogen公司)，鼠抗人TLR4單克隆抗體(Biolegend公司)，RT-PCR試劑盒(LifeInvitrogen公司)，PCR引物由LifeInvitrogen公司合成。PierceTM BCA Protein Assay Kit(Thermo公司)，B7-H1 ELISA kit(LifeInvitrogen)。

1.1.2實驗儀器 流式細胞儀(BD Biosciences)，Real-Time PCR System(model 7500，Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA)，PCR System 9700(GeneAmp)，酶標儀(BIO-RAD Model680，Japan),低溫高速離心機(Centrifuge 5810 R，eppendorf)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 使用RPMI1640培養基(含10%胎牛血清、濃度為100 U/ml青霉素和100 μg/ml硫酸鏈霉素)，在溫度37℃，體積分數為5%的CO2飽和濕度的恒溫培養箱中對BC T24細胞進行常規培養，每2 d按照1∶2或1∶3的比例傳代。

1.2.2TLR4信號通路活化 取對數生長期T24細胞，0.25%胰酶消化完全后，加入適當的完全培養基終止消化，1 500 r/min離心3 min，棄去上清后，以新鮮完全培養液重新懸浮，細胞計數儀計數，將細胞懸浮液稀釋至1.5×105cells/ml，以2 ml/孔接種于6孔培養板中，24 h后加入含有1 μg/ml的脂多糖，繼續孵育0、6、12和24 h。

1.2.3流式細胞儀檢測TLR4表達 按時間點收集細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，加入適當的完全培養基終止消化，1 500 r/min離心3 min，棄去上清，冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，重復3次，加入PE標記的鼠抗人TLR4單克隆抗體，在4℃的溫度下避光孵育30 min，孵育完畢后，冰PBS洗滌3次，將細胞團塊完全懸浮于冰PBS中，加入200 μl 4%多聚甲醛固定細胞，采用流式細胞儀檢測TLR4表達。

1.2.4RT-PCR測定B7-H1 mRNA表達 按時間點取脂多糖孵育結束的6孔板，棄去上清，加入1 ml/孔的Trizol裂解液，裂解細胞，按照相分離-沉淀RNA-洗滌RNA-RNA再溶解的步驟，提取各組T24細胞中總RNA。測量各組總RNA濃度，分別取等量的總RNA逆轉錄合成cDNA。測量逆轉錄后的各組cDNA濃度，分別取等量的cDNA進行RT-PCR，設定條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min。40個循環：95℃ 15 s，60℃ 1 min。B7-H1上游引物序列：5′-GCCGATACAAGCGAATTA-3′，下游引物序列：5′-TCTCAGTGTGCTGGTCTGGTCACAT-3′，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，上游引物序列：5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物序列：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，采用PCR System 9700進行分析，運用2-△△Ct法相對定量檢測各組 mRNA 的表達量。

1.2.5ELISA測定B7-H1蛋白表達 按時間點取脂多糖孵育結束的6孔板置于冰上，棄去上清，用冰PBS洗3遍，再加入1 ml/孔的冰PBS，用細胞刮仔細完全地刮下細胞。將刮下的含有細胞的PBS液轉移離心管內，3 000 r/min，4℃離心5 min，棄去上清液，加入250 μl/孔的混合裂解液，反應30 min。反應完畢后，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液。測定牛血清蛋白標準品(BCA)的標準曲線，計算各組樣品的總蛋白濃度。各組樣品取等量的總蛋白，按照B7-H1 ELISA試劑盒的規定步驟處理蛋白，用酶標儀測量各孔的吸光度，根據測定的B7-H1蛋白標準曲線，計算各組樣品對應的蛋白濃度。

1.3統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行χ2、t檢驗、Spearman相關性分析。

2 結 果

2.1脂多糖刺激時間對TLR4表達的影響 以1 μg/ml的脂多糖分別刺激T24細胞0、6、12、24 h，流式細胞儀檢測結果顯示TLR4陽性率隨刺激時間的增長而上調，且在12 h時(27.76%，3 551/12 790)達到最高值，24 h時(22.49%，3 057/13 590)表達略有降低，但仍較高。6 h(14.65%，1 856/12 672)、12 h、24 h時TLR4陽性率與0 h(3.55%，533/15 024)時比較差異有統計學意義(Plt;0.05)。

2.2B7-H1 mRNA及蛋白表達結果 B7-H1 mRNA、蛋白的表達隨刺激時間的增長而上調，且在12 h時達到最高值，24 h時表達略有降低，但仍較高。與0 h時比較，6 h和24 h T24細胞B7-H1 mRNA、蛋白表達量增高(Plt;0.05)，12 h顯著增高(Plt;0.01)。見表1。

2.3相關性分析 TLR4與B7-H1 mRNA、蛋白呈正相關(r=0.785，0.825；P=0.002，0.012)。

表1 B7-H1 mRNA、蛋白表達結果

與0 h比較：1)Plt;0.05，2)Plt;0.01

3 討 論

細胞介導的細胞免疫是一種機體抗腫瘤免疫的形式〔6〕，腫瘤抗原被機體免疫系統識別和提呈，對特異性細胞起到活化作用，進而殺傷腫瘤細胞。羅斌等〔7〕研究發現，腫瘤細胞可以通過缺如某些免疫分子和(或)異常表達，導致特異性細胞處于免疫耐受或無反應狀態，進而避開機體的免疫殺傷作用，這種現象既是免疫逃逸。隨著分子生物學的不斷發展和蛋白組學技術的研究深入，BC發生發展相關的特異性蛋白因子逐漸被發現，包括存活素(survivin)、凋亡抑制蛋白(livin)等〔8，9〕。Rosborough等〔10〕在研究中利用基因沉默(RNAi)技術，采用載有survivin siRNA的脂質體對原位BC小鼠模型進行治療，可發現在治療的3 w內，survivin mRNA的表達較治療前降低了70%，且腫瘤體積也有所降低，說明分子靶向survivin可作為臨床治療BC的新思路。livin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新發現的一員，研究表明轉染livin的反義寡核苷酸于BC細胞中可抑制livin的表達及細胞增殖，同時激活細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶caspase-3，促進癌細胞凋亡。這些因子雖然被發現，但是其在BC的發生、發展、轉移過程中的作用機制和相互作用尚未完全明確，因此本次研究信號通路及相關蛋白表達，以期為BC的靶向治療提供依據。

B7家族分子在多種造血干細胞惡性腫瘤、實體瘤和浸潤性免疫細胞中均表達，研究發現膀胱腫瘤中存在共刺激因子B7-H1的高表達。本研究說明脂多糖的確可以活化TLR4信號通路，增加T24細胞表面TLR4的表達量。且TLR4的影響下B7-H1 mRNA及蛋白表達升高，TLR4與B7-H1 mRNA及蛋白表達呈正相關。B7-H1是新近發現的共刺激因子，其與T細胞、B細胞表面的PD-1分子結合，可提供抑制性信號，抑制兩者的活化和增殖，并可誘導細胞毒性T細胞(CTL)凋亡。Huang等〔11〕研究發現抑制體外培養的BC T24細胞系細胞外信號調節激酶、C-Jun N端激酶(ERK、JNK)信號通路后，TLR4介導的B7-H1表達上調作用被削弱，提示絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的活化可能參與了B7-H1相關的膀胱腫瘤免疫逃逸過程。另外還有研究證實B7-H1可誘導Treg表面的Fas/FasL表達上調，促進白細胞介素-10(IL-10)的分泌以誘導活化的細胞凋亡〔12〕。還有研究〔13〕發現，自然殺傷(NK)細胞在B7-H1表達缺失的情況下仍能增強CTL的殺傷作用，阻斷B7-H1后則可增強鼠結腸炎性免疫應答。

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3Bardoli AD，Afshar M，Viney R，etal.The PD-1/PD-L1 axis in the pathogenesis of urothelial bladder cancer and evaluating its potential as a therapeutic target〔J〕.Future Oncol，2016；12(5)：595-600.

4郜 亮，馮向先.Toll樣受體4在惡性黑色素瘤中的表達及其介導腫瘤免疫逃逸的機制〔J〕.中華實驗外科雜志，2015；32(6)：1387-90.

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10Rosborough BR，Ra?ch-Regué D，Matta BM，etal.Murine dendritic cell rapamycin-resistant and rictor-independent mTOR controls IL-10，B7-H1，and regulatory T-cell induction〔J〕.Blood，2013；121(18)：3619-30.

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12林 城，陳 雄，劉靜南，等.PD-1/PD-L1信號通路在非小細胞肺癌免疫逃逸及其治療中的研究進展〔J〕.中國肺癌雜志，2014；17(10)：734-40.

13李旭宏，王曉波，余少鴻，等.NK細胞上清液提高CTL細胞對肝癌細胞殺傷力的研究〔J〕.檢驗醫學與臨床，2016；13(z1)：62-5.

〔2017-01-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

R73

A

1005-9202(2017)22-5528-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.018

江西省自然科學基金資助項目(No.20161BAB205271)

吳高亮(1978-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事泌尿系腫瘤研究。