老年宮頸癌組織中人乳頭狀瘤病毒16-E6、p53 mRNA表達及其與放療敏感性的相關性

王慶西

(山東大學附屬濟南市中心醫院，山東 濟南 250013)

老年宮頸癌組織中人乳頭狀瘤病毒16-E6、p53 mRNA表達及其與放療敏感性的相關性

王慶西

(山東大學附屬濟南市中心醫院，山東 濟南 250013)

目的分析老年宮頸癌組織中人乳頭狀瘤病毒(HPV)16-E6、p53 mRNA表達及其與放療敏感性的關系。方法40例宮頸癌患者均按計劃進行根治性放射治療前后采用實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(PT-PCR)檢測宮頸癌組織中HPV16-E6、p53 mRNA的表達水平，并根據治療結果分為有效組29例和無效組11例，分析HPV16-E6、p53與放療敏感性的關系。結果治療總有效率為72.50%；放療前后無效組2例HPV16-E6、p53 mRNA和蛋白差異無統計學意義(Pgt;0.05)，放療前后有效組4例HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA表達水平明顯改善，HPV16-E6蛋白表達水平顯著低于無效組，p53蛋白表達水平顯著高于無效組(Plt;0.05)。結論HPV16-E6感染、p53基因異常參與了老年宮頸癌發生、發展過程，檢測HPV16-E6、p53 mRNA的表達可判斷宮頸癌組織放療敏感性。

宮頸癌；放療敏感性；人乳頭狀瘤病毒(HPV)16-E6；p53 mRNA

正常宮頸發展為宮頸癌過程緩慢，其中人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染起一定促進作用〔1〕。目前臨床治療宮頸癌方法包括手術和放射治療，80%宮頸癌患者需要放療作為單獨治療或綜合治療的手段。但在臨床中發現，部分患者因腫瘤對放射線抵抗導致治療失敗，可能與不同個體對放射線敏感程度存在差異有關〔2〕。評估放療的敏感性有利于預測腫瘤對放射線反應，合理選擇放療方法，從而提高腫瘤放射治療的效果。p53屬于抑癌基因，過度表達可導致腫瘤細胞放射抗拒。本文分析老年宮頸癌患者HPV16-E6、p53表達及與放療敏感性的相關性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2015年11月至2016年11月山東大學附屬濟南市中心醫院老年宮頸癌患者40例，年齡61～76歲，平均(66.72±2.03)歲；宮頸癌國際婦產科聯盟(FIGO)分期：ⅡA期11例，ⅡB期29例。納入標準：①經組織病理學確診為宮頸癌；②經腹部B超、X線胸片、CT或磁共振成像(MRI)檢查，證實無遠處轉移；③首次治療為單純根治性放射治療；④依從性良好，主動配合完成療程，簽署同意書。排除標準：①術前全身化療、介入化療、插植放療等影響術后病理放射敏感性評價結果；②放療過程中出現嚴重不良反應者。

1.2放射治療方法 均接受根治性放射治療，采用可直線加速器6/10 MV X射線進行外照射，盆腔大野前后兩野對穿照射，照射野為(18～20 cm)×(16～20 cm)，2 Gy/次，1次/d，5次/w，盆腔外照射總劑量30 Gy后，將4 cm寬鉛塊遮擋照射野，保護直腸和膀胱，同時進行后裝腔內放療，6 Gy/次，1次/w，后裝劑量控制為36～42 Gy/6～7次，后裝放療當日不行外照射〔3,4〕。

1.3HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA表達水平檢測 放療前后均留取癌組織，提出RNA。根據放療治療結果，選擇有效組4例(標記1、2、3、4)和無效組2例(標記5、6)為檢測對象，選取放療前后癌組織進行檢查。同一患者取不同部位3處提取RNA，采用1 μg RNA行反轉錄反應，獲得的cDNA作為PCR模板，隨后進行RT-PCR檢測。

1.4HPV16-E6、p53蛋白表達水平檢測 試劑：ABI 1556試劑盒(美國Ambion)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(美國Pierce公司)，分別提取組織蛋白和檢測組織蛋白濃度。蛋白質溶液中加入4倍上樣緩沖液，100℃加熱5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質條帶，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉進行1 h封閉，經一抗孵育洗膜、二抗室溫培養1 h洗膜后，采用發光試劑盒檢測熒光。

1.5觀察指標 參考《實體瘤新的療效評價標準》〔5〕中相關宮頸癌療效判斷標準，完全緩解(CR)：病灶消失，且持續≥1個月；部分緩解(PR)：病灶最大徑×最大垂直徑減少50%以上，且持續≥1個月；穩定(SD)：病灶最大徑×最大垂直徑減少50%以下，或增加25%以下；進展(PD)：病灶最大徑×最大垂直徑增加25%以上，或有新病灶出現。根據治療效果分為有效組(CR+PR)29例和無效組(SD+PD)11例。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行t、χ2檢驗。

2 結 果

2.1放療結果 CR 11例，PR 18例，SD 6例，PD 5例，總有效率為72.50%。

2.2放療前后HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA水平比較 放療后有效組4例HPV16-E6 mRNA水平(分別為0.243 8±0.003、0.356 7±0.010、0.423 7±0.014、0.247 8±0.017)顯著低于放療前(0.913 5±0.025、0.921 0±0.023、0.902 4±0.024、0.912 3±0.023)，p53 mRNA表達水平(分別為1.897±0.041、1.656±0.042、1.598±0.040、1.698±0.038)顯著高于放療前(1.003±0.063、0.997±0.056、1.005±0.060、1.009±0.063，Plt;0.05)；放療前后無效組2例HPV16-E6 mRNA、p53 mRNA無顯著差異(分別為0.911 1±0.026、0.924 5±0.024 vs 0.879 1±0.025、0.924 6±0.026；0.979±0.062、1.003±0.063 vs 1.048±0.061、0.998±0.064，Pgt;0.05)。

2.3放療前后HPV16-E6、p53蛋白表達水平比較 放療前有效組和無效組HPV16-E6、p53蛋白表達水平無顯著差異(Pgt;0.05)，放療前后無效組HPV16-E6、p53蛋白表達水平無顯著差異(Pgt;0.05)，放療后有效組HPV16-E6蛋白水平顯著低于放療前、無效組，p53蛋白表達水平顯著高于放療前、無效組(Plt;0.05)。見表1。

表1 放療前后有效和無效組HPV16-E6、p53蛋白表達水平比較

與放療前比較：1)Plt;0.05；與無效組比較：2)Plt;0.05

3 討 論

據世界衛生組織(WHO)報道〔6〕，全世界每年新增宮頸癌44萬人次，發展中國家占80%以上。50～60歲年齡段婦女是宮頸癌高發人群。宮頸癌發生、發展過程十分復雜，涉及多種癌基因、抑癌基因異常。研究顯示HPV感染與宮頸癌發生有關。HPV屬于一種雙鏈、右手螺旋、嗜上皮性的DNA病毒〔7〕，高危型HPV包括HPV16、HPV18，是宮頸癌發生的獨立危險因素，可抑制抑癌基因表達，促進增殖基因表達，與潛在的惡性生物學行為有關。張莉華等〔8〕研究顯示，HPV16-E6參與宮頸癌發生、發展、侵襲轉移過程。E6轉化基因及產物是HPV16致癌的關鍵，但有關宮頸組織惡性轉化機制尚未完全明確。HPV感染所致的高級鱗狀上皮內病變中E6、E7蛋白表達水平增高，提示E6、E7表達與細胞惡性病變有關〔9〕。廖百花等〔10〕認為RNA干擾可抑制HPV復制，研究結果表明小鼠宮頸癌細胞瘤體經靶向轉染HPV16-siRNA后，HPV16-DNA明顯降低，抑制了HPV-DNA的復制，減緩腫瘤生長速度。龍小佳等〔11〕研究表明，HPV16-E6蛋白表達升高、p53蛋白表達降低可導致口腔癌發生發展。p53是一種抑癌基因〔12〕，其基因突變參與了多種惡性腫瘤的發生發展過程。HPV16-E6蛋白與野生型p53蛋白結合，改變p53蛋白分子結構和功能，引起p53誘導G1期阻滯減弱，導致病毒進入S期，一旦細胞增殖失控，將形成腫瘤。

放療過程中放射線將細胞DNA雙鏈斷裂(DSB)，起到殺死腫瘤細胞的目的〔13〕。由于細胞具有不同程度的DNA損傷修復能力，細胞照射后DNA修復能力將影響放療的效果。細胞修復能力與DSB修復蛋白功能、活性、蛋白自身等因素決定〔14〕。目前多數學者試圖通過改進放療技術或應用化療藥物增敏等提高放療效果，但宮頸癌內在放射敏感性決定了放療療效。張欣欣等〔15〕研究顯示，治療前患者血紅蛋白(Hb)含量、腫瘤大小、分化程度、病理類型等是影響宮頸癌放療敏感性的因素。李雪梅等〔16〕研究表明，CT灌注參數血容量、表面通透性可評估宮頸癌患者放化療敏感性。傳統預測腫瘤放療敏感性方法是在整體或細胞水平上進行，無法為治療、評價預后提供足夠數據。眭鴻穎等〔17〕研究結果顯示，p53蛋白與宮頸癌放療敏感性有相關性，可作為早期宮頸癌放療敏感性的預測指標。野生型p53可導致細胞凋亡，一旦p53突變，細胞凋亡將減少，對放療產生抗拒，降低放療敏感性。HPV E6基因可與突變的p53基因結合，在突變p53基因發揮作用前滅活，降低p53突變患者惡性病變風險。王媛等〔18〕研究顯示，以HPV-18為主的HPV感染可能影響宮頸癌放化療敏感性。童婷婷等〔19〕研究結果表明，p53高表達與宮頸癌放療抗拒有關，HPV DNA多重感染的宮頸癌患者對放療敏感性較差。HPV病毒反復感染，經整合入宿主染色體，編碼HPV16-E6蛋白，結合p53蛋白核心區，喪失p53對細胞周期調控作用，導致細胞復制失控，惡性克隆性增殖。梁少強等〔20〕研究表明，CCND1基因G870A位點多態性可作為高危型HPV相關宮頸癌放療敏感性的預測指標。

本研究提示檢測HPV16-E6、p53表達水平不僅有利于確診宮頸癌，還能判定宮頸癌放療敏感性。隨著立體定向適形、調強放療技術的不斷發展，放療過程中可更好地保護正常組織，使得腫瘤細胞得到更高的照射劑量。宮頸癌放療敏感性較差的患者可通過調節HPV16-E6、p53基因表達，增強放療敏感性，提高臨床治療效果。

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20梁少強,張 寧,黃 榮,等.CCND1基因G870A位點多態性對高危型HPV相關宮頸癌放療敏感性的影響〔J〕.中南大學學報(醫學版),2015;40(11):1205-9.

〔2017-08-29修回〕

(編輯 苑云杰)

R737.33

A

1005-9202(2017)22-5622-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.062

王慶西(1963-)，男，副主任技師，主要從事臨床檢驗研究。