河南省麥田豬殃殃對苯磺隆的抗性及ALS基因突變研究

高新菊,郭秀玲,陳 威,包來倉,馬毅輝,秦光宇,祖均懷,王恒亮

(1.河南省農業科學院植物保護研究所/河南省農作物病蟲害防治重點實驗室/農業部華北南部作物有害生物綜合治理重點實驗室/河南省作物保護國際聯合實驗室/河南省生物農藥工程研究中心，河南鄭州 450002；2.鄲城縣農業科學研究所，河南鄲城 477150； 3.河南省農藥檢定站，河南鄭州 450002)

河南省麥田豬殃殃對苯磺隆的抗性及ALS基因突變研究

高新菊1,郭秀玲2,陳 威1,包來倉3,馬毅輝1,秦光宇1,祖均懷1,王恒亮1

(1.河南省農業科學院植物保護研究所/河南省農作物病蟲害防治重點實驗室/農業部華北南部作物有害生物綜合治理重點實驗室/河南省作物保護國際聯合實驗室/河南省生物農藥工程研究中心，河南鄭州 450002；2.鄲城縣農業科學研究所，河南鄲城 477150； 3.河南省農藥檢定站，河南鄭州 450002)

為明確河南省部分地區麥田豬殃殃對苯磺隆的抗性水平及抗性靶標分子機制，對18個豬殃殃種群進行了乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)離體活性測定和ALS基因突變分析。結果表明，種群PDS-1、ZK-1、LH-1對苯磺隆產生了較高的抗性，ALS離體活性測定所得I50分別為11.27、10.26、8.19 μmol·L-1，抗性指數分別為93.92、85.50、68.25。種群ZK-1的6個檢測株中，ALS基因第590位的C突變為T，ALS酶第197位脯氨酸(CCC)突變為亮氨酸(CTC)；種群PDS-1的6個檢測株中，ALS基因第1 128位的T突變為A，ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)全部突變為谷氨酸(GAA)；種群LH-1的6個檢測株中，3株未檢測到突變，另外3株的ALS基因第1 128位的T突變為G，ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)突變為谷氨酸(GAG)。靶標ALS基因突變可能是豬殃殃對苯磺隆產生高抗性的重要原因之一。

河南??；豬殃殃；苯磺隆；抗性；ALS基因突變

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)抑制劑類除草劑是一類廣泛應用的除草劑，但其作用位點單一，長期、單一施用使雜草對其比較容易產生抗性[1-2]。截至2016年8月，全球已有159種雜草對ALS抑制劑類除草劑產生了抗性，使其成為抗性上升最快的一類除草劑[3]。苯磺隆(tribenuron-methyl)是由美國杜邦(DuPont)公司開發的一種ALS抑制劑類除草劑，在我國主要用于小麥田一年生闊葉雜草的防除，是我國使用面積最大、期限最長的除草劑品種之一。目前，我國許多地區的小麥田闊葉雜草，如播娘蒿(Descurainiasophia)[4-6]、薺菜(Capsellabursa-pastoris)[7-9]、麥家公(Lithospermumarvense)[10]等對苯磺隆的抗性水平已被相繼報道，其抗性問題日益突出。研究發現，ALS基因保守區的氨基酸突變是播娘蒿[4,6]、薺菜[8,11]對苯磺隆產生高水平抗性的重要原因之一。

豬殃殃(Galiumaparine)為茜草科豬殃殃屬雜草，攀援或蔓生，是我國冬小麥田的主要闊葉雜草之一，嚴重影響小麥產量及收割。目前，豬殃殃對苯磺隆的抗性水平及抗性分子機制已被一些學者報道。彭學崗等[12]采用溫室盆栽法和培養皿法測定了河南、安徽、山東、江蘇、河北、山西、陜西部分地區的豬殃殃對苯磺隆的抗性水平，其中，河南省許昌采集點抗藥性最高，溫室盆栽法和培養皿法測得抗性指數分別為4.3和2.2倍。Sun等[13]通過對敏感和抗藥型豬殃殃的ALS測序發現，與敏感型豬殃殃相比，抗藥型ALS第574位色氨酸被甘氨酸取代，這可能是豬殃殃對苯磺隆產生抗藥性的重要原因之一。目前，就河南省大部分地區麥田豬殃殃種群對苯磺隆的抗性水平及抗性分子機制尚未見報道。

本研究擬對河南省部分小麥主產區的18個豬殃殃種群進行ALS離體活性測定和ALS基因突變分析，以明確河南省不同地區豬殃殃種群對苯磺隆的抗性水平及抗性靶標分子機制，為制定合理、有效的防治對策、科學使用除草劑防治抗藥性雜草提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試豬殃殃種子：2013年5月底和2014年5月底采集于平頂山市、周口市等18個采樣點的小麥田，詳見表1。每個采樣點面積300～600 m2，所采集的豬殃殃種子混合作為一個種群。

1.2 方 法

1.2.1 試材培養

在直徑12 cm的塑料盆缽內，裝入風干過篩、混勻后的壤土，每盆播種經0.05%赤霉素處理24 h 后培養至露白的豬殃殃種子20粒，置于人工氣候箱(MGC-350HP型，上海天呈)內培養。光暗比14 h/10 h，溫度22 ℃/15 ℃，相對濕度為75%。出苗后，每盆定苗10株。

1.2.2 ALS離體活性測定

酶液制備：參考Ray[14]的方法，略有改動。將3～5輪葉期豬殃殃地上部分剪碎，取1 g放入預冷的研缽中，加入適量液氮快速研磨成細粉，再加入4 mL勻漿緩沖液[含1 mmol·L-1丙酮酸鈉(美國Amresco公司)，0.5 mmol·L-1氯化鎂，0.5 mmol·L-1TPP(氯化硫胺素焦磷酸鹽，索萊寶)和10 μmol·L-1FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸，索萊寶)的0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液]快速研磨，置于離心管中，用勻漿緩沖液定容至8 mL，用SORVALL Stratos冷凍型高速離心機(賽默飛世爾科技)于25 000 r·min-1、4 ℃下離心20 min；取上清液，緩慢加入硫酸銨晶體至50%飽和度，沉淀2 h后，于25 000 r·min-1、4 ℃下離心30 min；棄上清液，將沉淀用6 mL重懸浮緩沖液(含20 mmol·L-1丙酮酸鈉和0.5 mmol·L-1氯化鎂的0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液)重新懸浮，即得酶液，4 ℃保存，待測，每個處理重復3次。

ALS活力測定：參考范志金等[15]的方法。在10 mL具塞試管中加入0.9 mL酶反應液(含20 mmol·L-1丙酮酸鈉，0.5 mmol·L-1氯化鎂，0.5 mmol·L-1TPP和10 μmol·L-1FAD的0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液)、1 mL酶液和0.1 mL不同濃度的苯磺隆(98%原藥，山東華陽科技)藥液，使苯磺隆終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100、1 000 μmol·L-1，以加入0.1 mL蒸餾水的處理為對照。搖勻后置于35 ℃恒溫水浴中，1 h后加入0.2 mL 3 mol·L-1的硫酸終止反應；60 ℃水浴15 min后，分別加入1 mL 0.5%肌酸和5% α-萘酚(用2.5 mol·L-1的氫氧化鈉溶液配制)；60 ℃水浴顯色15 min，迅速置于冰浴中冷卻1 min，用752紫外可見分光光度計于525 nm 波長下測定吸光度值A525。計算各處理的ALS相對活性，ALS相對活性=不同苯磺隆濃度處理的A525/空白對照的A525×100%。

表1 豬殃殃采集地點與苯磺隆用藥歷史Table 1 Collecting sites of Galium aparine and their background of tribenuron-methyl application

1.2.3ALS基因突變分析

引物設計：根據豬殃殃ALS基因序列(GenBank登錄號：GU377313)，利用Primer Premier 5.0軟件設計3對引物(表2)，由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，擴增片段包含目前已報道抗性雜草ALS基因保守區的8個突變位點，這些位點對應擬南芥(Arabidopsisthaliana)的ALS氨基酸分別是Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653和Gly654[16-18]。

DNA提取、擴增及測序：用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技)對18個種群的3～5輪葉期豬殃殃葉片進行單株DNA提取，每個種群6株。每個DNA樣本的PCR擴增(9700型PCR擴增儀，美國ABI公司)重復3次。PCR反應體系為：Taq酶(寶生物)0.25 μL、10×PCR Buffer 5 μL、25 mmol·L-1MgCl23 μL、dNTP mix(2.5 mmol·L-1)4 μL、模板DNA 2 μL、上下游引物各2 μL，滅菌ddH2O補足50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR產物用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技)回收后送至英濰捷基(上海)貿易有限公司測序。將測序完成的目的DNA片段序列與擬南芥敏感生物型的ALS基因序列用DNAMAN軟件進行序列比對，尋找突變位點。

表2 擴增豬殃殃ALS基因片段的引物Table 2 Primers for ALS gene of Galium aparine

1.3 數據處理

ALS離體活性測定得到的數據參考Seefeldt等[19]的方法進行分析。使用Sigma Plot 12.5軟件中非線性回歸方程y=C+(D-C)/[1+(x/I50)b]進行劑量反應曲線擬合，計算各種群的I50。式中，y為特定除草劑用量下所測雜草的ALS相對活性；C為劑量反應下限；D為劑量反應上限；x為除草劑用量；I50為豬殃殃不同生物型ALS活性被抑制50%時的苯磺隆濃度；b為斜率。

抗性指數(RI)=抗性種群的I50/敏感種群的I50。

2 結果與分析

2.1 離體條件下苯磺隆對豬殃殃ALS活性的影響

由表3可知，豬殃殃種群XX-1的ALS對苯磺隆最敏感，其I50僅為0.12 μmol·L-1(抗性指數為1.00)；豬殃殃種群PDS-1、ZK-1、LH-1對苯磺隆的I50分別為11.27、10.26、8.19 μmol·L-1，其抗性指數分別為93.92、85.50、68.25，表明這些采集點的豬殃殃種群的ALS對苯磺隆的敏感性明顯降低；其他采集點豬殃殃種群的I50在0.20～1.14 μmol·L-1之間，抗性指數在1.67～9.50之間。

2.2 不同豬殃殃種群ALS基因突變分析

與擬南芥敏感生物型及不同豬殃殃種群間的ALS基因對比分析可知(表4)，豬殃殃種群ZK-1的6個檢測株中，ALS基因第590位堿基C突變為T，導致ALS酶的第197位脯氨酸(CCC)突變為亮氨酸(CTC)；種群PDS-1的6個檢測株中，ALS基因第1 128位的T突變為A，導致ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)突變為谷氨酸(GAA)；種群LH-1的6個檢測株中，3株未檢測到突變，另外3株的ALS基因第1 128位的T突變為G，導致ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)突變為谷氨酸(GAG)；其他種群均未檢測到突變。

表3 苯磺隆對不同豬殃殃種群ALS離體活性的抑制作用Table 3 Inhibition of tribenuron-methyl on ALS activity in vitro of different populations of Galium aparine

C：劑量反應下限；D：劑量反應上限；I50：ALS離體活性抑制中濃度；b：斜率；R：相關系數；RI：抗性指數。

CandD：Lower and upper limit of dose-dependent response,respectively;I50：The tribenuron-methyl concentration required for 50% inhibition of ALS activityinvitro;b：The slope at theI50;R：Correlation coefficient;RI：Resistance index.

表4 豬殃殃種群ALS基因突變點及相應的氨基酸Table 4 Mutant of ALS gene and amino acid sequences among different populations of Galium aparine

3 討 論

離體條件下，靶標酶相對活性測定可以反映供試雜草對除草劑的抗藥性[20]。本研究中，由于種群XX-1的采集點從未施用過除草劑，其ALS離體活性的I50僅為0.12 μmol·L-1，在供試的18個種群中最低，對苯磺隆比較敏感；而豬殃殃種群PDS-1、ZK-1、LH-1的I50分別為11.27、10.26、8.19 μmol·L-1，相對于種群XX-1的抗性指數分別為93.92、85.50、68.25，表明這些采集點豬殃殃種群的ALS對苯磺隆有較高的抗性。這與Han等[21]對播娘蒿ALS的研究結果類似。

雜草體內除草劑作用位點發生改變、雜草代謝解毒能力增強、雜草的屏蔽作用或與作用位點的隔離作用是雜草對除草劑產生抗性的三大主要機制，其中，靶標基因突變是最重要的原因之一[22]。本研究通過對不同豬殃殃種群的ALS基因片段擴增并測序發現，與敏感型擬南芥和豬殃殃的ALS相比，豬殃殃種群ZK-1的6個檢測株中，ALS基因第950位堿基C突變為T，使相應的197位脯氨酸為亮氨酸；種群PDS-1的6個檢測株中，ALS基因第1 128位的T突變為A，使相應的376位天冬氨酸變為谷氨酸；種群LH-1的6個檢測株中，3株未檢測到突變，另外3株的ALS基因第1 128位的T突變為G，使相應的376位天冬氨酸變為谷氨酸，這可能是導致豬殃殃對苯磺隆產生高抗性的重要原因之一。Sun等[13]發現抗苯磺隆豬殃殃的ALS第574位色氨酸被甘氨酸取代，本研究中ALS第197位脯氨酸被亮氨酸取代，第376位天冬氨酸被谷氨酸取代是在抗苯磺隆豬殃殃中首次發現。

本課題組對供試的豬殃殃種群進行了整株抗性測定，發現其抗性水平與ALS離體活性測定所得抗性水平基本一致。本研究中靶標ALS基因檢測明確了河南省部分地區麥田豬殃殃對苯磺隆的抗性機理，但有關解毒代謝酶與抗藥性的關系、交互抗性等問題有待于進一步研究。

[1]TRANEL P J,WRIGHT T R.Resistance of weeds to ALS-inhibiting herbicides:What have we learned? [J].WeedScience,2002,50(6):701.

[2] 隋標峰,張朝賢,崔海蘭,等.雜草對AHAS抑制劑的抗藥性分子機理研究進展[J].農藥學學報,2009,11(4):400.

SUI B F,ZHANG C X,CUI H L,etal.Advances in molecula mechanism of AHAS-inhibiting herbicides resistance [J].ChineseJournalofPesticideScience,2009,11(4):400.

[3]HEAP I.The international survey of herbicide resistant weeds [EB/OL] //.[2016-08-22].http://www.weedscience.org/Summary/SOASummary.aspx.

[4]CUI H L,ZHANG C X,ZHANG H J,etal.Confirmation of flixweed(Descurainiasophia) resistance to tribenuron in China [J].WeedScience,2008,56(6):777-778.

[5] 高興祥,李 美,高宗軍,等.山東省小麥田播娘蒿對苯磺隆的抗性測定[J].植物保護學報,2014,41(3):374.

GAO X X,LI M,GAO Z J,etal.Determination of flixweed(Descurainiasophia) resistance to tribenuron-methyl in Shandong Province [J].JournalofPlantProtection,2014,41(3):374.

[6]DEND W,LIU M J,YANG Q,etal.Tribenuron-methyl resistance and mutation diversity of Pro197 in fixweed(DescurainiaSophia L.) accessions from China [J].PesticideBiochemistryandPhysiology,2015,117:70.

[7]WANG G Q,CUI H L,ZHANG H J,etal.Tribenuron-methyl resistant shepherd's purse(Capsellabursa-pastorisL.) Medik.) in Hebei Province of China [J].AgriculturalSciencesinChina,2011,10(8):1243.

[8]CUI H L,LI X J,WANG G Q,etal.Acetolactate synthase proline(197) mutations confer tribenuron-methyl resistance in Capsella bursa-pastoris populations from China [J].PesticideBiochemistryandPhysiology,2012,102(3):231.

[9] 劉君良,王金信,劉偉堂,等.中國北方部分地區麥田薺菜對苯磺隆的抗性水平[J].農藥學學報,2011,13(4):350-351.

LIU J L,WANG J X,LIU W T,etal.Resistance level ofCapsellabursa-pastoristo tribenuron-methyl in winter wheat fields in northern China [J].ChineseJournalofPesticideScience,2011,13(4):350-351.

[10] 吳小虎,王金信,劉偉堂,等.山東省部分市縣麥田雜草麥家公Lithospermumarvense對苯磺隆的抗藥性[J].農藥學學報,2011,13(6):600.

WU X H,WANG J X,LIU W T,etal.Resistance ofLithospermumarvenseto tribenuron-methyl in winter wheat fields in part of Shandong Province [J].ChineseJournalofPesticideScience,2011,13(6):600.

[11]JIN T,LIU J L,HUAN Z B,etal.Molecular basis for resistance to tribenuron in shepherd’s purse(Capsellabursa-pastorisL.) Medik.) [J].PesticideBiochemistryandPhysiology,2011,100(2):162.

[12] 彭學崗,王金信,段 敏,等.中國北方部分冬麥區豬殃殃對苯磺隆的抗性水平[J].植物保護學報,2008,35(5):458.

PENG X G,WANG J X,DUAN M,etal.The resistance to tribenuron-methyl inGaliumaparinein winter wheat fields in northern China [J].JournalofPlantProtection,2008,35(5):458.

[13]SUN J,WANG J X,ZHANG H J,etal.Study on mutations in ALS for resistance to tribenuron-methyl inGaliumaparineL [J].AgriculturalSciencesinChina,2011,10(1):89.

[14]RAY T B.Site of action of chlorsulfuron:Inhibition of valine and isoleucine biosynthesis in plants [J].PlantPhysiology,1984,75(3):827-828.

[15] 范志金,錢傳范,于維強,等.氯磺隆和苯磺隆對玉米乙酰乳酸合成酶抑制作用的研究[J].中國農業科學,2003,36(2):174.

FAN Z J,QIAN C F,YU W Q,etal.Study on enzymatic inhibition of acetolactate synthase from maize(ZeamaysL.) by chlorsulfuron and tribenuron-methyl [J].ScientiaAgriculturaSinica,2003,36(2):174.

[16]LAPLANTE J,RAJCAN I,TARDIF F J.Multiple allelic forms of acetohydroxyacid synthase are responsible for herbicide resistance inSetariaviridis[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2009,119(4):581.

[17] 盧宗志,張朝賢,傅俊范,等.抗芐嘧磺隆雨久花ALS基因突變研究[J].中國農業科學,2009,42(10):3517.

LU Z Z,ZHANG C X,FU J F,etal.Molecular basis of resistance to bensulfuron-methyl inMonochoriakorsakowii[J].ScientiaAgriculturaSinica,2009,42(10):3517.

[18]MASSA D,KRENZ B,GERHARDS R.Target-site resistance to ALS-inhibiting herbicides inAperaspicaventipopulations is conferred by documented and previously unknown mutations [J].WeedResearch,2011,51(3):295,302.

[19]SEEFELDT S S,JENSEN J E,FUERST E P.Log-logistic analysis of herbicide dose-response relationships [J].WeedTechnology,1995,9(2):219.

[20] 崔海蘭.播娘蒿(Descurainiasophia)對苯磺隆的抗藥性研究[D].北京:中國農業科學院,2009:60.

CUI H L.The resistance of flixweed(Descurainiasophia) to tribenuron-methyl [D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences,2009:60.

[21]HAN X J,DONG Y,SUN X N,etal.Molecular basis of resistance to tribenuron-methyl inDescurainiasophiaL. populations from China [J].PesticideBiochemistryandPhysiology,2012,104:79.

[22] 張朝賢,倪漢文,魏守輝,等.雜草抗藥性研究進展[J].中國農業科學,2009,42(4):1274.

ZHANG C X,NI H W,WEI S H,etal.Current advances in research on herbicide resistance [J].ScientiaAgricultureSinica,2009,42(4):1274.

ResistancetoTribenuron-MethylandALSMutationsinGaliumaparineinWheatFieldsinHenanProvince

GAOXinju1,GUOXiuling2,CHENWei1,BAOLaicang3,MAYihui1,QINGuangyu1,ZUJunhuai1,WANGHengliang1

(1.Henan Key Laboratory of Crop Pest Control/IPM Key Laboratory in Southern Part of North China for Ministry of Agriculture/ International Joint Research Laboratory for Crop Protection of Henan/Biological Pesticides Engineering Research Center of Henan Province/Institute of Plant Protection,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou,Henan 450002,China; 2.Dancheng Institute of Agricultural Sciences,Dancheng,Henan 477150,China; 3.Institute for the Control of Agrochemicals of Henan province,Zhengzhou,Henan 450002,China)

To investigate the resistance levels and molecular mechanism ofGaliumaparineto tribenuron-methyl in winter wheat fields in Henan province,eighteenGaliumaparinepopulations were assessed by acetolactate synthase(ALS) activityinvitroassay and analysis ofALSmutations.The results showed thatGaliumaparinepopulations PDS-1,ZK-1,and LH-1 had higher levels of resistance than those of others,and theirI50of ALS activityinvitroassay were 11.27,10.26 and 8.19 μmol·L-1,respectively,and the corresponding relative resistance index were 93.92,85.50 and 68.25,respectively.ALSsequences analysis indicated that C→T at 590th base proline(CCC) at position 197 of the ALS was substituted by leucine(CTC) in six PDS-1 plants.Aspartic acid(GAT) at position 376 was substituted by glutamic acid(GAA) in six ZK-1 plants.Aspartic acid(GAT) at position 376 was substituted by glutamic acid(GAT) in three LH-1 plants.The Pro197 or Asp376 mutations in ALS could be one of important reasons for the observed high resistance to tribenuron-methyl.

Henan province;Galiumaparine; Tribenuron-methyl; Resistance;ALSmutation

時間：2017-11-14

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171114.1028.032.html

2017-01-06

2017-04-26

河南省農業科學院自主創新專項(2013ZZ22,2016ZC43)

E-mail：gaoxj19@qq.com(高新菊)；E-mail:hlw2000@126.com(王恒亮，與第一作者同等貢獻)

王恒亮(E-mail:hlw2000@126.com)

S512.1；S451.1

A

1009-1041(2017)11-1518-07