紫外線對HaCaT細胞中瞬時受體電位錨蛋白1的影響

劉影 張婷 趙光明 倪靜 王宇鵬 劉越堅 宋智琦

116011大連醫科大學附屬第一醫院皮膚科（劉影、張婷、趙光明、倪靜、王宇鵬、宋智琦），中心實驗室（劉越堅）

紫外線對HaCaT細胞中瞬時受體電位錨蛋白1的影響

劉影 張婷 趙光明 倪靜 王宇鵬 劉越堅 宋智琦

116011大連醫科大學附屬第一醫院皮膚科（劉影、張婷、趙光明、倪靜、王宇鵬、宋智琦），中心實驗室（劉越堅）

目的 探討HaCaT細胞中瞬時受體電位錨蛋白1（TRPA1）的光控作用及其機制。方法 培養的HaCaT細胞分為225 mJ/cm2UVA刺激組和25 mJ/cm2UVB刺激組，UVA刺激組分為空白對照組（僅有HaCaT細胞）、視黃醛組、UVA組、視黃醛+UVA組（UVA-TRPA1對照組）、視黃醛+UVA+肉桂醛組（UVA-TRPA1激動組）、視黃醛+UVA+樟腦組（UVA-TRPA1抑制組）；UVB刺激組分為空白對照組（僅有HaCaT細胞）、視黃醛組、UVB組、視黃醛+UVB組（UVB-TRPA1對照組）、視黃醛+UVB+肉桂醛組（UVB-TRPA1激動組）、視黃醛+UVB+樟腦組（UVB-TRPA1抑制組）。qPCR、Western印跡檢測HaCaT細胞中TRPA1的表達。流式細胞儀檢測各組HaCaT細胞鈣離子內流的變化。結果 qPCR和Western印跡顯示，HaCaT細胞中有TRPA1 mRNA及蛋白的表達。UVA作用后空白對照組、視黃醛組、UVA組、視黃醛+UVA組熒光強度分別為155.06±7.62、148.37±18.77、166.92±3.71、331.333±40.563，組間差異有統計學意義（F=44.509，P＜0.01）。UVB作用后空白對照組、視黃醛組、UVB組、視黃醛+UVB組熒光強度分別為150.20±1.73、171.66±56.23、147.56±6.60、250.44±9.13，組間差異有統計學意義（F=85.261，P＜0.01），視黃醛+UVA/UVB組熒光強度均高于空白對照組（q值分別為18.442、6.052，P＜0.01）。TRPA1激動劑和拮抗劑可調節UVA、UVB所引起的鈣離子內流的變化（P＜0.001），在UVA、UVB作用下，TRPA1激動劑組熒光強度均高于對照組（q值分別為14.934、32.770，P ＜ 0.001），TRPA1抑制劑組熒光強度均低于對照組（q值分別為7.986、14.596，P ＜0.001）。結論 TRPA1在皮膚HaCaT細胞中有表達，UVA或UVB可通過TRPA1調控HaCaT細胞的鈣離子內流。

角蛋白細胞；紫外線；瞬時受體電位通道；錨蛋白類；HaCaT細胞

瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道是位于真核細胞膜上的一類重要的非選擇性陽離子通道，最早發現于果蠅的視覺系統，突變體果蠅對持續的光刺激產生瞬時而非持續的峰電位［1］。大多數TRP通道為鈉離子、鈣離子等滲透型通道，其中瞬時受體電位錨蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）為鈣離子滲透型通道。Bellono等［2-3］提出TRPA1可能是唯一的眼外光轉導通路，表皮黑素細胞受到紫外線輻射時，Gα/q11蛋白-磷脂酶C信號轉導途徑被激活，隨后激活TRPA1通道使大量的鈣離子內流，從而導致早期黑素合成增加。為了進一步探討TRPA1在角質形成細胞中的光控作用，我們研究了在長波紫外線（UVA）、中波紫外線（UVB）作用下，HaCaT細胞中視黃醛依賴性鈣離子內流的情況以及TRPA1通道抑制及激活狀態下對HaCaT細胞視黃醛依賴性鈣離子內流的影響。

材料和方法

一、材料

DMEM培養基（美國Corning公司），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、1%青霉素-鏈霉素及含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、視黃醛、TRPA1通道激動劑-肉桂醛、TRPA1通道拮抗劑-樟腦（美國Sigma公司）。總RNA提取試劑（Trizol）、反轉錄試劑盒（Prime ScriptTMRT reagent Kit）、熒光定量試劑盒（SYBR?Premix ExTaq?Ⅱ）及qPCR引物設計（大連寶生物工程有限公司）。qPCR引物設計（大連寶生物工程有限公司）；兔抗人TRPA1多克隆抗體（中國臺灣Abnova公司），兔抗人β肌動蛋白多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（北京博奧生物集團有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Fluo-3AM鈣離子熒光探針（上海碧云天生物技術有限公司）；HaCaT細胞株（廣州賽庫生物技術有限公司）、人胚腎293T細胞（HEK293T細胞株，美國ATCC細胞庫）均為本實驗室保存細胞株。

二、方法

1.細胞培養：HaCaT細胞用含15%FBS和DMEM培養基于37℃、5%CO2培養箱中培養，每2天更換1次培養基，待細胞長滿瓶底后，以0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞并傳代。HEK293T細胞用含10%FBS和DMEM培養基于37℃、5%CO2的培養箱中培養，2～3 d更換1次培養基，待細胞密度融合至70%～80%時，以0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞并傳代。選擇對數生長期HaCaT細胞、HEK293T細胞進行后續實驗。HaCaT細胞為實驗組，HEK293T細胞為陽性對照組。

2.細胞分組：視黃醛溶于無水乙醇中，終濃度為12 μmol/L，肉桂醛、樟腦分別溶于DMSO中，終濃度分別為500 μmol/L和1 mmol/L，在實驗前混合到細胞外溶液中（最終DMSO濃度＜1‰）。實驗分為225 mJ/cm2UVA刺激組和25 mJ/cm2UVB刺激組，UVA刺激組分為空白對照組（僅有HaCaT細胞）、視黃醛組、UVA組、視黃醛+UVA組（UVA-TRPA1對照組）、視黃醛+UVA+肉桂醛組（UVA-TRPA1激動組）、視黃醛+UVA+樟腦組（UVA-TRPA1抑制組）；UVB刺激組分為空白對照組（僅有HaCaT細胞）、視黃醛組、UVB組、視黃醛+UVB組（UVBTRPA1對照組）、視黃醛+UVB+肉桂醛組（UVBTRPA1激動組）、視黃醛+UVB+樟腦組（UVBTRPA1抑制組）。

3.實時熒光定量PCR（qPCR）檢測TRPA1基因表達：采用Trizol試劑提取實驗組HaCaT細胞及陽性對照組HEK293T細胞總RNA，紫外/可見光分光光度儀檢測總RNA的純度及濃度，采用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA后，采用熒光定量試劑盒進行目的基因及內參基因的擴增。目的基因TRPA1正向引物：5′-TTCCTGGAAAGCTTCATGTTGAAAG-3′，反向引物：5′-TCAAAGTGACATCAGGTGTGTTGG-3′，擴增片段為120 bp；內參基因GAPDH正向引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反向引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴增片段為138 bp。PCR反應體系為20 μl，擴增程序為預變性95℃30 s，PCR反應為95℃5 s，60℃30 s，共40個循環。

4.Western印跡法檢測TRPA1蛋白表達：收集HaCaT細胞及HEK293T細胞，適量RIPA裂解液裂解細胞提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，上樣20 μg電泳、轉膜及封閉，給予一抗（兔抗人TRPA1多克隆抗體及兔抗人β肌動蛋白多克隆抗體濃度均為1∶1 500）4℃過夜，二抗（山羊抗兔IgG抗體濃度1∶3 000）室溫孵育1 h，ECL化學發光顯色液顯色，凝膠成像系統觀察結果，目的蛋白條帶TRPA1與β肌動蛋白條帶的灰度值比值作為蛋白表達的半定量指標。

5.流式細胞儀檢測HaCaT細胞內鈣離子：根據UVA、UVB刺激進行細胞分組處理，培養24 h，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，棄上清。隨后，加入500 μl正常生理緩沖液［NPB，為正常生理溶液（NPS，120 mmol/L NaCl、3.3mmol/LKCl、1.2mmol/LKH2PO4、0.8mmol/LMgSO4、24 mmol/L NaHCO3）中加 入1.0 m mol/L CaCl2和 0.1%BSA（重量/體積）］重懸細胞；室溫下加入Fluo-3AM（終濃度5 mmol/L）及視黃醛、肉桂醛、樟腦，給予UVA/UVB照射，室溫下孵育45 min。然后179×g，離心10min，棄上清，用500 μl NPS洗滌細胞沉淀2次，最后加入500 μl NPS重懸。使用流式細胞儀測定熒光強度（鈣離子濃度的相對含量），激發波長488 nm，發射波長530 nm。

6.統計學分析：采用SPSS17.0統計軟件，計量資料用±s表示。兩組間均數比較用t檢驗，多組間均數比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），采用q檢驗、LSD法進行組間多重比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、TRPA1在HaCaT細胞中的表達

HaCaT細胞及HEK293T細胞中TRPA1 mRNA的表達量分別為0.31±0.09、0.93±0.05，差異有統計學意義（t=10.262，P ＜0.001）。HaCaT細胞及HEK293T細胞中TRPA1/β肌動蛋白條帶的灰度比分別為0.27±0.08、0.49±0.02，差異有統計學意義（t=4.701，P＜0.05）。見圖1。

圖1 Westren印跡法檢測HaCaT細胞及HEK293T細胞內源性瞬時受體電位錨蛋白1（TRPA1）的表達 TRPA1 Westren印跡電泳圖。1：HaCaT；2：HEK293T

二、紫外線照射對HaCaT細胞視黃醛依賴性鈣離子內流的影響

1.UVA照射：UVA增加HaCaT細胞中視黃醛依賴性的鈣離子內流，空白對照組、視黃醛組、UVA組、視黃醛+UVA組間熒光強度差異有統計學意義（F=44.509，P＜0.01），見表1。與空白對照組相比，視黃醛組、UVA組鈣離子內流沒有增加（q值分別為0.780、1.382，P ＞ 0.05），視黃醛 +UVA組鈣離子內流顯著增加（q=18.442，P＜0.01）。

表1 UVA、UVB對HaCaT細胞視黃醛依賴性鈣離子內流的影響

2.UVB照射：UVB增加HaCaT細胞中視黃醛依賴性的鈣離子內流，空白對照組、視黃醛組、UVB組、視黃醛+UVB組間熒光強度差異有統計學意義（F=85.261，P＜0.01）。見表1。與空白對照組相比，視黃醛組、UVB組未見鈣離子的增加（q值分別為1.295、-0.160，P ＞ 0.05），視黃醛 +UVB組鈣離子內流顯著增加（q=6.052，P＜0.01）。

三、TRPA1的激活與抑制對紫外線照射介導HaCaT細胞視黃醛依賴性鈣離子內流的調節

1.UVA照射：TRPA1激活UVA介導的HaCaT細胞視黃醛依賴性的鈣離子內流，對照組、視黃醛+UVA+肉桂醛組、視黃醛+UVA+樟腦組間熒光強度差異有統計學意義（F=136.229，P＜0.01）。與對照組相比，視黃醛+UVA+肉桂醛組鈣離子內流顯著增加（q=14.934，P＜0.001），視黃醛 +UVA+樟腦組鈣離子內流顯著減少（q=7.986，P＜0.001）。見表2，圖2。

表2 TRPA1調節UVA、UVB介導的HaCaT細胞視黃醛依賴性鈣離子的內流（熒光強度，±s）

表2 TRPA1調節UVA、UVB介導的HaCaT細胞視黃醛依賴性鈣離子的內流（熒光強度，±s）

注：n≥3

圖2 TRPA1調節UVA介導的HaCaT細胞視黃醛依賴性鈣離子的內流（M1數值為相對熒光強度）

2.UVB照射：TRPA1激活UVB介導的視黃醛依賴性HaCaT細胞的鈣離子內流，視黃醛+UVB組、視黃醛+UVB+肉桂醛組、視黃醛+UVB+樟腦組間熒光強度差異有統計學意義（F=639.058，P＜0.01）。見表2，圖3。與對照組相比，視黃醛+UVB+肉桂醛組鈣離子內流顯著增加（q=32.770，P＜0.001），視黃醛+UVB+樟腦組鈣離子內流顯著減少（q=14.596，P ＜ 0.001）。

圖3 TRPA1調節UVB介導的HaCaT細胞視黃醛依賴性鈣離子的內流（M1數值為相對熒光強度）

討 論

TRPA1最初被認為是機械性刺激的感受器，受到如物理刺激（溫度、機械力等）、化學刺激（pH值、信息素等）等不同機制的激活和調控［4］。近期研究發現，TRPA1通路是目前唯一的眼外光轉導通路，可被紫外線所激活［2-3］。因此，TRPA1在皮膚光生物學方面可能發揮作用。

鈣離子作為胞內第二信使，在細胞生命活動中起著重要的作用，如參與遞質和激素的合成與釋放［5］、促進表皮角質形成細胞的增殖、分化及細胞間黏附等［6-7］。本研究結果表明，UVA及UVB均可促進HaCaT細胞視黃醛依賴性鈣離子內流；進一步的研究發現，激活或者抑制TRPA1通道能夠顯著增加或減少UVA、UVB介導的HaCaT細胞視黃醛依賴性鈣離子內流。視網膜色素上皮細胞特異蛋白65（RPE65）由Hamel等［8］于1993年發現，定位于染色體lp31，是視網膜色素上皮細胞大量特異性表達、高度保守的蛋白序列，后于2005年由Redmond等［9］證實為視黃醇異構酶。RPE65是視網膜內維生素A循環又稱視循環的重要結構，被認為是催化全反式視黃酯轉變成11-順-視黃醇的異構酶之一，后者再經過一系列代謝轉變成視紫紅質，參與視覺系統中光信號的傳導過程［10-11］。有研究發現，角質形成細胞中亦有RPE65的表達［12］。由此我們推測在HaCaT細胞中，紫外線所引起鈣離子內流顯著增加的效應與哺乳動物視網膜中視循環相類似：可能是通過RPE65催化全反式視黃酯向順式視黃醇的反應，從而參與表皮細胞的光控作用。因此TRPA1的光通道作用機制可能是紫外線照射與視黃醛共孵育的HaCaT細胞后，使TRPA1離子通道開放，細胞內鈣離子顯著增加，從而激活鈣離子觸發的級聯反應。

綜上所述，紫外線激活TRPA1通道導致黑素細胞早期黑素合成增加的效應與引起角質形成細胞內鈣離子顯著增加的效應均體現表皮細胞中紫外線與TRPA1之間的密切聯系，從而我們認為，TRPA1在角質形成細胞中具有光控作用。

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Effect of ultraviolet radiation on expression of transient receptor potential ankyrin 1 in HaCaT cells

Liu Ying,Zhang Ting,Zhao Guangming,Ni Jing,Wang Yupeng,Liu Yuejian,Song Zhiqi
Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China（Liu Y,Zhang T,Zhao GM,Ni J,Wang YP,Song ZQ）;Central Laboratory,The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China（Liu YJ）

Song Zhiqi,Email:szqdalian@163.com

Objective To investigate the photoregulation of transient receptor potential ankyrin 1（TRPA1）in HaCaT cells,and to explore its mechanisms.Methods Cultured HaCaT cells were divided into 225-mJ/cm2UVA radiation groups and 25-mJ/cm2UVB radiation groups.HaCaT cells in the UVA radiation groups were further classified into 6 groups:blank control group 1 receiving no treatment,retinal group 1 treated with 12 μmol/L retinal alone,UVA group treated with 225 mJ/cm2UVA radiation alone,retinal+UVA group（UVA-TRPA1 control group）,retinal+UVA+500 μmol/L cinnamaldehyde group（UVA-TRPA1 agonist group）and retinal+UVA+1 mmol/L camphor group（UVA-TRPA1 antagonist group）.Additionally,HaCaT cells in the UVB radiation groups were also further classified into 6 groups:blank control group 2 receiving no treatment,retinal group 2 treated with 12 μmol/L retinal alone,UVB group treated with 25-mJ/cm2UVB radiation,retinal+UVB group（UVB-TRPA1 control group）,retinal+UVB+500 μmol/L cinnamaldehyde group（UVB-TRPA1 agonist group）and retinal+UVB+1 mmol/L camphor group（UVB-TRPA1 antagonist group）.Real-time fluorescence-based quantitative PCR（qPCR）and Western blot analysis were performed to determine the mRNA and protein expression of TRPA1 respectively.Flow cytometry was conducted to investigate changes of calcium influx in HaCaT cells in the above groups.Results qPCR and Western blot analysis showed that TRPA1 mRNA and protein were expressed in HaCaT cells.The fluorescence intensity of calcium influx significantly differed among the blank control group 1,retinal group 1,UVA group and retinal+UVA group（155.06±7.62,148.37±18.77,166.92±3.71 and 331.333±40.563;F=44.509,P＜0.01）,as well as among the blank control group 2,retinal group 2,UVB group and retinal+UVB group（150.20±1.73,171.66±56.23,147.56±6.60 and 250.44 ± 9.13;F=85.261,P ＜ 0.01）.Additionally,retinal+UVA/UVB groups showed significantly higher fluorescence intensity of calcium influx compared with the blank control groups（q=18.442,6.052,P ＜ 0.01）.The TRPA1 agonist cinnamaldehyde and its antagonist camphor could regulate the UVA-and UVB-induced calcium influx（P ＜ 0.001）.Compared with the blank control group 1 and 2 respectively,the fluorescence intensity of retinal-dependent calcium influx was significantly higher in the UVA/UVB-TRPA1 agonist group（q=14.934,32.770,P ＜ 0.001）,and significantly lower in the UVA/UVBTRPA1 antagonist group（q=7.986,14.596,P ＜ 0.001）.Conclusion TRPA1 is expressed in HaCaT cells,and UVA or UVB can regulate the calcium influx in HaCaT cells by adjusting the activity of TRPA1.

Keratinocytes;Ultraviolet rays;Transient receptor potential channels;Ankyrins;HaCaT cells

宋智琦，Email：szqdalian@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.004

國家自然科學基金（81472865）；遼寧省自然科學基金（2014023005）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81472865）;Natural Science Foundation of Liaoning Province of China（2014023005）

2016-12-09）

（本文編輯：朱思維 顏艷）