蘋果MdCaM的克隆及其對果實(shí)釆后非生物脅迫的響應(yīng)

蘇麗艷，田愛梅，陶貴榮，李 蒙

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065)

鈣調(diào)蛋白(CaM)是生物細(xì)胞內(nèi)一種結(jié)構(gòu)保守型很強(qiáng)的調(diào)控蛋白，也是研究得最多的Ca2+受體蛋白，其原型是由148個氨基酸組成的小分子酸性蛋白(17 kDa)，具有專一性結(jié)合鈣離子的EF hand結(jié)構(gòu)域[1]。CaM只有在結(jié)合Ca2+后形成Ca2+/CaM復(fù)合物才有生物活性[2]。Ca2+/CaM復(fù)合物發(fā)揮生物活性的機(jī)制主要有2種，一種是該復(fù)合物直接與下游靶蛋白相互作用，另一種是通過活化依賴Ca2+/CaM復(fù)合物的蛋白激酶起作用[2-3]。

鈣調(diào)蛋白在植物體內(nèi)參與多種生理活動的調(diào)節(jié)，如參與激素反應(yīng)[4]、調(diào)節(jié)基因表達(dá)[5]、參與調(diào)節(jié)植物發(fā)育[6]、參與植物對許多脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等[7-9]。目前，已經(jīng)從小麥、大豆、玉米、煙草、香蕉、臍橙等多種植物中克隆了CaM基因，目前對CaM基因在響應(yīng)脅迫信號中的功能有了初步的了解，例如擬南芥的AtCaM基因與冷脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[10-11]；另有研究表明，調(diào)控植物耐鹽性相關(guān)的蛋白均受到Ca2+/CaM復(fù)合物的調(diào)控[12-13]；在香蕉中，CaM被證明參與香蕉幼苗對干旱、低溫等的逆境調(diào)控過程[14]。

蘋果(Malusdomestica)是我國的主要果品，也是世界上種植最廣、產(chǎn)量最多的水果。市場供應(yīng)的蘋果多以儲藏果為主，蘋果從采后包裝、運(yùn)輸、貯藏到消費(fèi)者手的整個過程中都不可避免地受到擠壓、振動、碰撞等導(dǎo)致的損傷、高溫和低氧的儲藏環(huán)境等逆境脅迫因素的影響，從而極易發(fā)生病害和腐爛。因此，了解蘋果釆后響應(yīng)逆境脅迫的生理機(jī)制，篩選關(guān)鍵響應(yīng)因子，對開展蘋果抗逆品種改良有重要的指導(dǎo)意義。

周倩[15]已通過RACE技術(shù)獲得MdCaM全長(GenBank登錄號為HM369505)，并證明MdCaM是秦冠蘋果抗褐斑病關(guān)鍵調(diào)控基因。然而，關(guān)于MdCaM在蘋果釆后逆境脅迫下的表達(dá)模式及功能尚不清楚。本研究根據(jù)MdCaM全長cDNA序列設(shè)計特異性引物，克隆了MdCaM基因。利用MEGA 5.0 軟件將蘋果MdCaM與其他物種的鈣調(diào)蛋白氨基酸序列進(jìn)行了聚類分析。同時，采用熒光定量PCR技術(shù)分析了MdCaM在蘋果釆后非生物脅迫(損傷、低氧、高溫)下的表達(dá)情況，明確該基因在逆境脅迫下的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步分析MdCaM蛋白在響應(yīng)逆境脅迫中的功能，為將來開展蘋果抗逆品種改良提供基因儲備，為提高蘋果釆后對外界脅迫環(huán)境的適應(yīng)能力的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗用植物材料均采自陜西省銅川市蘋果示范種植基地6年生紅富士蘋果樹。采后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗室，用蒸餾水小心清洗且紗布擦干后，選取色澤一致、大小均勻(單果重約250 g)、無損傷病害果實(shí)進(jìn)行脅迫處理，處理后果實(shí)貯存于4 ℃，相對濕度為90%的無光照儲藏室中。

本研究中所用的分子試劑，高保真聚合酶Ex-Taq酶、SYBR premix EX TagTM reagent 試劑盒均購自TaKaRa公司；DNA 凝膠回收試劑購自O(shè)mega Bio-tek公司；其他分子試劑及載體等均購于生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 逆境脅迫處理方法

1.2.1 損傷脅迫 將蘋果置于離地面60 cm的地方，使其自由落地跌落大理石地面，每個蘋果正反雙面各跌落一次，以未處理蘋果為對照，儲藏于溫度為4 ℃，相對濕度為90%～93%無光照儲藏室中。每組設(shè)3個生物樣本重復(fù)，每次取9個蘋果用于樣品分析。分別于處理后0，1，6，12，24 h取材，將果實(shí)削成1 cm3左右小塊存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高溫脅迫 將蘋果分別置于溫度為4，20，40 ℃，相對濕度為90%～93%無光照儲藏室內(nèi)。每組設(shè)3個生物樣本重復(fù)，每次每個處理組取9個蘋果用于樣品分析，分別于處理后0，1，6，12，24 h取材，將果實(shí)削成1 cm3左右小塊存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 低氧脅迫 將蘋果儲藏于30 L的容器中，通入100%N2+0 O2和97%N2+3%O2。每組3個重復(fù)，儲藏于4 ℃，相對濕度為90%～93%無光照儲藏室內(nèi)。每次每個處理組取9個蘋果用于樣品分析，分別于處理后0，1，6，12，24 h取材，將果實(shí)削成1 cm3左右小塊存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 果實(shí)RNA提取和MdCaM基因克隆方法

采用CTAB法提取果實(shí)樣品的總RNA。利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，具體試驗體系、方法和步驟見試劑盒說明書。根據(jù)蘋果MdCaM基因序列全長，利用Primer 5.0設(shè)計引物(上海生工合成)，MdCaM-F和MdCaM-R，序列見表1。以cDNA為模板擴(kuò)增MdCaM基因全長。反應(yīng)體系為25 μL，程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s 共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，DNA凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，連接pMD19-T載體進(jìn)行T/A克隆，DNA測序由上海生物工程有限公司完成。

1.4 MdCaM基因擴(kuò)增及熒光定量表達(dá)分析

以上述cDNA為模板，以NCBI上已經(jīng)登錄的MdActin(登錄號：AB638619.1)為內(nèi)參，采用RT-PCR方法對其進(jìn)行表達(dá)分析。引物根據(jù)NCBI已經(jīng)登錄的MdActin和MdCaM序列設(shè)計，分別為Q_MdActin-F、Q_MdActin-R；Q_MdCaM-F、Q_MdCaM-R，具體序列見表1。操作步驟按照SYBR premix EX TagTM reagent 試劑盒說明書進(jìn)行。qPCR體系為10 μL，包括5 μL SYBR premix Ex Taq混合液，1 μL cDNA，引物各0.25 μL，ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃變性3 min；然后，95 ℃ 20 s，54 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40 次循環(huán)；每次循環(huán)第3 步進(jìn)行熒光采集，最后退火至65 ℃，每隔30 s 上升0.5 ℃，至95 ℃變性1 min。qRT-PCR 反應(yīng)于Bio-RAD C1000TM Thermal Cycler 上進(jìn)行，使用CFX96TM 系統(tǒng)進(jìn)行熒光采集。cDNA標(biāo)樣和待測樣均設(shè)置3 次重復(fù)。試驗結(jié)果用2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MdCaM克隆的電泳檢測

對紅富士蘋果的MdCaM基因全長序列進(jìn)行克隆(圖1)，將測序結(jié)果與已知MdCaM基因序列比對，結(jié)果一致。MdCaM包含450 bp的開放閱讀框，編碼150個氨基酸。根據(jù)在線軟件(http：//www.expasy.org/tools/pi_tool.html)預(yù)測其分子量約為16.875 7 kDa，預(yù)測等電點(diǎn)(pI)為4.12。利用DNAman軟件將MdCaM與其他物種的CaM氨基酸序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，MdCaM的蛋白序列與其他物種鈣調(diào)蛋白基因具有很高同源性，且具有2個鈣結(jié)合蛋白的保守結(jié)構(gòu)域EF-hand(圖2)。

2.2 MdCaM序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

根據(jù)編碼MdCaM的氨基酸序列并結(jié)合其他植物鈣調(diào)蛋白基因的編碼氨基酸序列，采用MEGA5.0構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果表明，MdCaM基因與芥藍(lán)和擬南芥的親緣關(guān)系最近。

1.DNA的PCR結(jié)果；M.分子量標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 MdCaM基因在損傷脅迫下的表達(dá)分析

利用熒光定量PCR對MdCaM基因損傷脅迫后不同時間的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：與對照組相比，MdCaM基因的相對表達(dá)量在損傷脅迫早期1，6，12 h均有顯著性提高，且在損傷處理6 h后達(dá)到峰值。損傷脅迫6 h后，對照組的相對表達(dá)量為1.1，而損傷組為5.7，約為對照組的5倍，12 h后表達(dá)量較脅迫早期(1，6 h)有所下降，但仍明顯高于同時期對照果，損傷處理24 h后MdCaM基因的相對表達(dá)量恢復(fù)正常水平(圖4)。

黑色下劃線為2個EF-hand保守結(jié)構(gòu)域。 Two conserved domain EF-hands were marked by black lines.

圖3 根據(jù)氨基酸序列聚類的植物鈣調(diào)蛋白基因進(jìn)化關(guān)系分析

2.4 MdCaM基因在高溫脅迫下的表達(dá)分析

如圖5所示，與低溫(4 ℃)相比，20，40 ℃儲藏1 h后，MdCaM相對表達(dá)量呈現(xiàn)明顯上調(diào)，并隨著時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，12 h后達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量呈下降趨勢，但顯著高于同期對照組。

2.5 MdCaM基因在低氧脅迫下的表達(dá)分析

在無氧(0 O2)條件下，MdCaM在處理后1 h被迅速誘導(dǎo)呈上調(diào)表達(dá)，對照組的相對表達(dá)量為1.1，而無氧組為3.2，約為對照組的3倍，6 h后迅速恢復(fù)正常水平；在低氧(3% O2)儲藏條件下，MdCaM仍呈現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，但在處理后6 h達(dá)到最大值，12 h后恢復(fù)正常水平。在低氧(0 O2和3% O2)誘導(dǎo)12 h后，MdCaM表達(dá)量與對照組無顯著性差異(圖6)。

***.P<0.001；**.P<0.01； *.P<0.05。圖5-6同。***.P<0.001；**.P<0.01； *.P<0.05。The same as Fig.5-6.

圖5 高溫脅迫下MdCaM基因的表達(dá)情況Fig.5 Relative expression of MdCaM gene under high temperature stress

圖6 低氧脅迫下MdCaM基因的表達(dá)情況

3 討論

植物抗逆是指植物抵抗干旱、水澇、低溫、高溫、鹽堿、病蟲害等不良環(huán)境的能力。逆境可分為生物脅迫和非生物脅迫2種。其中，非生物脅迫條件下植物自身調(diào)節(jié)機(jī)制的研究越來越受到重視，已成為培育抗逆新品種的重要條件之一。損傷、高溫和低氧是蘋果儲藏過程中的主要非生物脅迫因子，是影響北方地區(qū)蘋果儲藏品質(zhì)的重要因素。

已有研究表明，CaM是植物體內(nèi)普遍存在的一類Ca2+結(jié)合蛋白，在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[17-22]。鈣調(diào)蛋白本身不具有催化活性，只要通過與其下游鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白(CaMBP)結(jié)合調(diào)控細(xì)胞的生理功能，從而影響植物的生長發(fā)育[23]。如毛白楊CaM通過提高G6PDHase、ATPase活性提高其幼苗在低溫條件下的存活率和抗凍性，從而證明CaM與植物的抗凍性相關(guān)[24]。因此，CaMBP的鑒定是研究CaM生理功能作用的重要手段。目前，已經(jīng)鑒定了一系列參與逆境脅迫反應(yīng)的CaMBP，如NAD激酶、一氧化氮合成酶、谷氨酸脫羧酶等[25]。研究證明，蘋果鈣調(diào)蛋白是抗褐斑病相關(guān)蛋白[15]，關(guān)于其在蘋果響應(yīng)損傷、高溫和低氧等非生物脅迫中的功能尚無相關(guān)報道。

本研究結(jié)果表明，MdCaM對不同脅迫的響應(yīng)模式不同。損傷處理后，MdCaM迅速應(yīng)答，其相對表達(dá)量在處理后6 h達(dá)到峰值，約為為對照組的5倍，24 h后漸恢復(fù)正常水平；在20，40 ℃ 2個高溫逆境脅迫環(huán)境下，MdCaM均在脅迫早期被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，且在處理后12 h左右達(dá)到峰值，隨后表達(dá)水平小幅下調(diào)，但仍然顯著高于對照組；MdCaM在無氧(0 O2)脅迫早期受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在處理后1 h達(dá)到峰值，約為對照組的3倍，與無氧脅迫相比，低氧環(huán)境下(3%O2)MdCaM相對表達(dá)量上調(diào)幅度較小，應(yīng)答較為遲緩，6 h后達(dá)到峰值，為對照組的2倍，后均恢復(fù)正常水平。從以上研究結(jié)果看，MdCaM基因受到損傷、高溫、低氧等脅迫條件誘導(dǎo)，特別是在脅迫早期有明顯應(yīng)答。說明蘋果MdCaM基因具有響應(yīng)損傷、高溫、低氧等非生物脅迫的能力，可能在適應(yīng)脅迫環(huán)境的早期發(fā)揮重要作用。本研究為進(jìn)一步利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和植物遺傳育種方法揭示MdCaM的功能及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為闡明蘋果釆后抗逆生理機(jī)制及進(jìn)一步利用該基因進(jìn)行抗性育種提供重要參考依據(jù)。然而，MdCaM響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制如何，有哪些下游靶蛋白參與其調(diào)控過程，其與下游靶蛋白相互作用的信號通路及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等問題亟待進(jìn)一步深入研究。